Àwọn metabolites immunomodulatory jẹ́ àmì pàtàkì nínú àyíká tumor microenvironment (TME), ṣùgbọ́n pẹ̀lú àwọn ìyọkúrò díẹ̀, ìdámọ̀ wọn kò tíì di mímọ̀ rárá. Níbí, a ṣe àyẹ̀wò àwọn èèmọ́ àti àwọn sẹ́ẹ̀lì T láti inú èèmọ́ àti ascites ti àwọn aláìsàn pẹ̀lú high-grade serous carcinoma (HGSC) láti fi ìṣàfihàn àwọn ìpín TME onírúurú wọ̀nyí hàn. Àwọn sẹ́ẹ̀lì ascites àti tumor ní ìyàtọ̀ metabolite tó pọ̀. Ní ìfiwéra pẹ̀lú ascites, àwọn sẹ́ẹ̀lì T tí ń wọ inú tumor ní ọ̀pọ̀lọpọ̀ ní 1-methylnicotinamide (MNA). Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ìpele MNA nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T ga sí i, ìfarahàn nicotinamide N-methyltransferase (ẹ́ńsáìmù kan tí ó ń ṣe ìyípadà ìyípadà àwọn ẹgbẹ́ methyl láti S-adenosylmethionine sí nicotinamide) ní ààlà sí àwọn fibroblasts àti àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor. Ní ti iṣẹ́, MNA ń fa àwọn sẹ́ẹ̀lì T láti tú cytokine tumor necrosis factor alpha jáde. Nítorí náà, MNA tí TME ti yọrí sí ìṣètò àjẹ́sára ti àwọn sẹ́ẹ̀lì T ó sì dúró fún àfojúsùn immunotherapy tó ṣeéṣe fún ìtọ́jú àrùn jẹjẹrẹ ènìyàn.
Àwọn metabolites tí a rí láti inú èèmọ́ lè ní ipa ìdènà jíjinlẹ̀ lórí ààbò àrùn ìdènà àrùn, àti pé ẹ̀rí púpọ̀ sí i fihàn pé wọ́n tún lè ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí agbára ìdarí pàtàkì fún ìlọsíwájú àrùn (1). Yàtọ̀ sí ipa Warburg, iṣẹ́ àìpẹ́ yìí ti bẹ̀rẹ̀ sí í ṣe àfihàn ipò ìdàpọ̀ àwọn sẹ́ẹ̀lì èèmọ́ àti ìbáṣepọ̀ rẹ̀ pẹ̀lú ipò ààbò àrùn ti àyíká kékeré (TME). Àwọn ìwádìí lórí àwọn àwòṣe eku àti àwọn sẹ́ẹ̀lì T ènìyàn ti fihàn pé ìdàpọ̀ glutamine (2), ìdàpọ̀ oxidative (3) àti ìdàpọ̀ glucose (4) lè ṣiṣẹ́ láìdádúró lórí onírúurú àwọn ẹgbẹ́ sẹ́ẹ̀lì ààbò. Ọ̀pọ̀lọpọ̀ metabolites nínú àwọn ọ̀nà wọ̀nyí ń dí iṣẹ́ ìdàpọ̀ àrùn ti àwọn sẹ́ẹ̀lì T lọ́wọ́. A ti fihàn pé dídènà coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) lè ba ìdàgbàsókè àwọn sẹ́ẹ̀lì T jẹ́, àti pé ìbísí BH4 nínú ara lè mú ìdáhùn ààbò àrùn ìdènà àrùn ìdènà àrùn tí CD4 àti CD8 ń ṣe ìrànlọ́wọ́ fún pọ̀ sí i. Ní àfikún, ipa ìdàpọ̀ àrùn ti kynurenine lè ṣeé gbàlà nípasẹ̀ lílo BH4 (5). Nínú ìyípadà isocitrate dehydrogenase (IDH) glioblastoma, ìtújáde enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) ń dí ìṣiṣẹ́ sẹ́ẹ̀lì T lọ́wọ́, ìbísí àti iṣẹ́ cytolysis (6). Láìpẹ́ yìí, a ti fihàn pé methylglyoxal, àbájáde glycolysis, ni àwọn sẹ́ẹ̀lì suppressor ti orísun myeloid ń ṣe, àti pé ìyípadà sẹ́ẹ̀lì T ti methylglyoxal lè dí iṣẹ́ sẹ́ẹ̀lì T effector lọ́wọ́. Nínú ìtọ́jú, ìdènà methylglyoxal lè borí ìṣiṣẹ́ àwọn sẹ́ẹ̀lì suppressor tí a ti yọrí sí myeloid (MDSC) kí ó sì mú ìtọ́jú ìdènà checkpoint pọ̀ sí i nínú àwọn àpẹẹrẹ eku (7). Àwọn ìkẹ́kọ̀ọ́ wọ̀nyí papọ̀ tẹnu mọ́ ipa pàtàkì ti àwọn metabolites tí a ti yọrí sí TME nínú ṣíṣàkóso iṣẹ́ àti ìṣiṣẹ́ sẹ́ẹ̀lì T.
A ti royin iṣẹ ṣiṣe ti awọn sẹẹli T ni ọpọlọpọ igba ninu akàn ovarian (8). Eyi jẹ apakan nitori awọn abuda iṣelọpọ ti o wa ninu hypoxia ati awọn iṣan tumor ti ko dara (9), eyiti o yorisi iyipada glucose ati tryptophan si awọn ọja miiran gẹgẹbi lactic acid ati kynurenine. Lactate ti o pọ ju ti o wa ni ita ita dinku iṣelọpọ interferon-γ (IFN-γ) ati pe o n mu iyatọ ti awọn ẹgbẹ kekere myelosuppressive (10, 11). Lilo tryptophan taara n ṣe idiwọ idagbasoke sẹẹli T ati idilọwọ ifihan agbara olugba sẹẹli T (12-14). Pelu awọn akiyesi wọnyi, ọpọlọpọ iṣẹ ti o yi iṣelọpọ ajẹsara pada ni a ṣe ni in vitro T cell culture lilo awọn media ti o dara julọ, tabi ni opin si awọn awoṣe homologous eku ni vivo, mejeeji ninu eyiti o ṣe afihan iyatọ ti awọn aarun eniyan ati agbegbe macro ati micro.
Ohun kan tí ó wọ́pọ̀ nínú àrùn jẹjẹrẹ ẹyin ni ìtànkálẹ̀ peritoneal àti ìfarahàn ascites. Ìkójọpọ̀ omi sẹ́ẹ̀lì nínú ascites ní í ṣe pẹ̀lú àrùn tó ti lọ síwájú àti àsọtẹ́lẹ̀ tí kò dára (15). Gẹ́gẹ́ bí ìròyìn ti sọ, apá àrà ọ̀tọ̀ yìí jẹ́ hypoxic, ó ní ìwọ̀n gíga ti vascular endothelial growth factor (VEGF) àti indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), ó sì wọ inú rẹ̀ nípasẹ̀ àwọn sẹ́ẹ̀lì T regulatory àti myeloid inhibitory cells (15-18). Àyíká ìṣiṣẹ́ ara ti ascites lè yàtọ̀ sí ti tumor fúnra rẹ̀, nítorí náà, àtúntò àwọn sẹ́ẹ̀lì T nínú ààyè peritoneal kò ṣe kedere. Ní àfikún, àwọn ìyàtọ̀ pàtàkì àti àìdọ́gba láàrín ascites àti metabolites tí ó wà nínú àyíká tumor lè dí wíwọlé àwọn sẹ́ẹ̀lì aláàbò ara àti iṣẹ́ wọn lórí àwọn tumor lọ́wọ́, a sì nílò ìwádìí síwájú sí i.
Láti yanjú àwọn ìṣòro wọ̀nyí, a ṣe àgbékalẹ̀ ọ̀nà ìyàsọ́tọ̀ sẹ́ẹ̀lì onímọ̀lára àti liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) láti ṣe ìwádìí lórí onírúurú sẹ́ẹ̀lì (pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + àti CD8 + T) àti láàárín àti láàárín àwọn èèmọ́. Àwọn metabolites rẹ̀ ń ta àwọn sẹ́ẹ̀lì nínú ascites àti àyíká èèmọ́ kan náà ti aláìsàn. A lo ọ̀nà yìí ní ìsopọ̀ pẹ̀lú high-dimensional flow cytometry àti single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) láti pèsè àwòrán ipò ìṣẹ̀dá ara àwọn ènìyàn pàtàkì wọ̀nyí. Ọ̀nà yìí fi hàn pé ìbísí pàtàkì wà nínú ìpele 1-methylnicotinamide (MNA) nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T tumor, àti pé àwọn ìwádìí in vitro fihàn pé ipa immunomodulatory ti MNA lórí iṣẹ́ sẹ́ẹ̀lì T kò tíì hàn tẹ́lẹ̀. Ní gbogbogbòò, ọ̀nà yìí fi ìbáṣepọ̀ ìṣẹ̀dá ara-ẹni hàn láàárín àwọn èèmọ́ àti àwọn sẹ́ẹ̀lì amúnilára, ó sì fúnni ní òye àrà ọ̀tọ̀ nípa àwọn metabolites ìṣàkóso ara-ẹni, èyí tí ó lè wúlò fún ìtọ́jú àwọn àǹfààní ìtọ́jú àrùn jẹjẹrẹ ovarian tí ó dá lórí sẹ́ẹ̀lì T.
A lo cytometry sisan onisẹpo giga lati ṣe iṣiro gbigba glukosi ni akoko kanna [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) ati iṣẹ mitochondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) jẹ awọn ami aṣoju ẹgbẹ-ẹgbẹ ti o ṣe iyatọ awọn sẹẹli ajẹsara ati awọn olugbe sẹẹli tumor (Tabili S2 ati Aworan S1A). Itupalẹ yii fihan pe ni akawe pẹlu awọn sẹẹli T, awọn sẹẹli ascites ati awọn sẹẹli tumor ni awọn ipele gbigba glukosi ti o ga julọ, ṣugbọn wọn ni awọn iyatọ kekere ninu iṣẹ mitochondrial. Gbigba glukosi apapọ ti awọn sẹẹli tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] jẹ igba mẹta si mẹrin ti awọn sẹẹli T, ati gbigba glukosi apapọ ti awọn sẹẹli CD4 + T jẹ igba 1.2 ti awọn sẹẹli CD8 + T, eyiti o tọka si pe awọn lymphocytes ti n wọ inu tumor (TIL) ni awọn ibeere ti iṣelọpọ oriṣiriṣi paapaa ninu TME kanna (Aworan 1A). Ní ìyàtọ̀ sí èyí, iṣẹ́ mitochondrial nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor jọ ti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + T, iṣẹ́ mitochondrial ti àwọn irú sẹ́ẹ̀lì méjèèjì sì ga ju ti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD8 + T lọ (Àwòrán 1B). Ní ​​gbogbogbòò, àwọn àbájáde wọ̀nyí fi ìpele iṣelọpọ hàn. Iṣẹ́ metabolic ti àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor ga ju ti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + T lọ, iṣẹ́ metabolic ti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + T ga ju ti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD8 + T lọ. Láìka àwọn ipa wọ̀nyí sí àwọn irú sẹ́ẹ̀lì, kò sí ìyàtọ̀ déédé nínú ipò metabolic ti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + àti CD8 + T tàbí ìwọ̀n ìbátan wọn nínú ascites ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn èèmọ́ (Àwòrán 1C). Ní ​​ìyàtọ̀ sí èyí, nínú ìpín sẹ́ẹ̀lì CD45, ìpín àwọn sẹ́ẹ̀lì EpCAM+ nínú èèmọ́ pọ̀ sí i ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn èèmọ́ (Àwòrán 1D). A tún rí ìyàtọ̀ metabolic tí ó ṣe kedere láàrín àwọn ẹ̀yà EpCAM+ àti EpCAM-cell. Àwọn sẹ́ẹ̀lì EpCAM+ (tumor) ní ìgba glucose gíga àti iṣẹ́ mitochondrial ju àwọn sẹ́ẹ̀lì EpCAM- lọ, èyí tí ó ga ju iṣẹ́ metabolic ti fibroblasts nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor nínú TME lọ (Àwòrán 1, E àti F).
(A àti B) Ìwọ̀n ìfọ́nrán àárín (MFI) ti gbígbà glucose (2-NBDG) (A) àti ìṣiṣẹ́ mitochondrial ti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + T (MitoTracker pupa dúdú) (B) Àwọn àwòrán aṣojú (òsì) àti àwọn dátà tí a ṣe àkọsílẹ̀ (Ọ̀tún), àwọn sẹ́ẹ̀lì CD8 + T àti àwọn sẹ́ẹ̀lì EpCAM + CD45-tumor láti inú ascites àti tumor. (C) Ìpíndọ́gba àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + àti CD8 + (ti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD3 + T) nínú ascites àti tumor. (D) Ìpíndọ́gba àwọn sẹ́ẹ̀lì EpCAM + tumor nínú ascites àti tumor (CD45−). (E àti F) EpCAM + CD45-tumor àti EpCAM-CD45-matrix glucose gbigba (2-NBDG) (E) àti ìṣiṣẹ́ mitochondrial (MitoTracker pupa dúdú) (F) àwọn àwòrán aṣojú (òsì) àti àwọn dátà tí a ṣe àkọsílẹ̀ (Ọ̀tún) Àwọn sẹ́ẹ̀lì Ascites àti tumor. (G) Àwọn àwòrán aṣojú ti ìfihàn CD25, CD137 àti PD1 nípasẹ̀ ìṣàn cytometry. (H àti I) Ìfihàn CD25, CD137 àti PD1 lórí àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + T (H) àti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD8 + T (I). (J àti K) Àwọn ìrísí ìrántí aláìgbọ́n, àárín (Tcm), olùṣe (Teff) àti ìrántí olùṣe (Tem) tí ó dá lórí ìfihàn CCR7 àti CD45RO. Àwọn àwòrán aṣojú (òsì) àti dátà tábùlà (ọtún) ti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + T (J) àti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD8 + T (K) nínú àwọn ascites àti èèmọ́. Àwọn ìwọ̀n P tí a pinnu nípasẹ̀ ìdánwò t-paired (*P<0.05, **P<0.01 àti ***P<0.001). Ìlà náà dúró fún àwọn aláìsàn tí ó báramu (n = 6). FMO, ìmọ́lẹ̀ tí a yọ kúrò ní ọ̀kan; MFI, agbára ìmọ́lẹ̀ àárín.
Àtúnyẹ̀wò síwájú fi àwọn ìyàtọ̀ pàtàkì mìíràn hàn láàrín ipò phenotypic cell T tí a ti yanjú gidigidi. Àwọn tí a ti mú ṣiṣẹ́ (Àwòrán 1, G sí I) àti ìrántí olùṣe (Àwòrán 1, J àti K) nínú èèmọ́ pọ̀ sí i ju ascites lọ (ìwọ̀n àwọn cell CD3 + T). Bákan náà, ṣíṣàyẹ̀wò phenotype nípa ìfìhàn àwọn àmì ìṣiṣẹ́ (CD25 àti CD137) àti àwọn àmì ìparẹ́ [protein ikú cell tí a ti ṣètò 1 (PD1)] fihàn pé bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn ànímọ́ ìṣiṣẹ́ ti àwọn ènìyàn wọ̀nyí yàtọ̀ síra (Àwòrán S1, B sí E), Ṣùgbọ́n a kò rí ìyàtọ̀ pàtàkì nínú ìṣiṣẹ́ ti àwọn ènìyàn wọ̀nyí nígbà gbogbo (Àwòrán S1, F sí I). A fi àwọn èsì wọ̀nyí múlẹ̀ nípa lílo àwọn ọ̀nà ẹ̀kọ́ ẹ̀rọ láti fi àwọn phenotypic cell hàn láìfọwọ́sí (21), èyí tí ó tún fi hàn pé iye àwọn cell strain egungun (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) wà nínú ascites aláìsàn (Àwòrán S2A). Láàrín gbogbo àwọn irú sẹ́ẹ̀lì tí a ti dámọ̀, iye sẹ́ẹ̀lì myeloid yìí fi ìgbara glucose tó ga jùlọ àti ìṣiṣẹ́ mitochondrial hàn (Àwòrán S2, B sí G). Àwọn àbájáde wọ̀nyí fi ìyàtọ̀ tó lágbára hàn láàárín ọ̀pọ̀lọpọ̀ irú sẹ́ẹ̀lì tí a rí nínú ascites àti èèmọ́ nínú àwọn aláìsàn HGSC.
Ìpèníjà pàtàkì nínú òye àwọn ànímọ́ ìṣẹ̀dá TIL ni àìní láti ya àwọn àpẹẹrẹ sẹ́ẹ̀lì T sọ́tọ̀ tí ó péye, dídára àti iye tí ó wà lára ​​èèmọ́. Àwọn ìwádìí tuntun ti fihàn pé yíyà sọ́tọ̀ àti àwọn ọ̀nà ìdàgbàsókè bead tí a gbé ka orí ìṣàn cytometry lè yọrí sí àwọn ìyípadà nínú àwọn profaili metabolite sẹ́ẹ̀lì (22-24). Láti borí ìṣòro yìí, a ṣe àtúnṣe ọ̀nà ìdàgbàsókè bead láti ya TIL sọ́tọ̀ àti láti ya sọ́tọ̀ kúrò nínú àrùn jẹjẹrẹ ẹyin ènìyàn tí a ti yọ kúrò nípasẹ̀ iṣẹ́ abẹ kí a tó ṣe ìwádìí nípasẹ̀ LC-MS/MS (wo Àwọn Ohun èlò àti Ọ̀nà; Àwòrán 2A). Láti ṣe àyẹ̀wò ipa gbogbogbòò ti ìlànà yìí lórí àwọn ìyípadà metabolite, a fi àwọn profaili metabolite ti àwọn sẹ́ẹ̀lì T tí àwọn olùfúnni ní ìlera ṣiṣẹ́ wéra lẹ́yìn ìgbésẹ̀ ìyàsọ́tọ̀ bead tí a kọ sílẹ̀ pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a kò ya bead sọ́tọ̀ ṣùgbọ́n tí wọ́n wà lórí yìnyín. Ìṣàyẹ̀wò ìṣàkóso dídára yìí rí i pé ìbáṣepọ̀ gíga wà láàrín àwọn ipò méjì wọ̀nyí (r = 0.77), àti pé àtúnṣe ìmọ̀-ẹ̀rọ ti ẹgbẹ́ àwọn metabolites 86 ní àtúnṣe gíga (Àwòrán 2B). Nítorí náà, àwọn ọ̀nà wọ̀nyí lè ṣe ìwádìí metabolite tó péye nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí wọ́n ń ṣe àfikún irú sẹ́ẹ̀lì, nípa bẹ́ẹ̀ wọ́n ń pèsè ìpìlẹ̀ gíga àkọ́kọ́ fún dídá àwọn metabolite pàtó mọ̀ nínú HGSC, èyí sì ń jẹ́ kí àwọn ènìyàn ní òye tó jinlẹ̀ nípa ètò ìṣiṣẹ́ ara-ẹni lórí ìbálòpọ̀.
(A) Àwòrán onípele ti ìdàgbàsókè magnetic bead. Ṣáájú ìwádìí láti ọwọ́ LC-MS/MS, àwọn sẹ́ẹ̀lì náà yóò gba ìpele mẹ́ta tí ó tẹ̀lé ara wọn ti ìdàgbàsókè magnetic bead tàbí kí wọ́n dúró lórí yìnyín. (B) Ipa ti irú ìdàgbàsókè lórí ọ̀pọ̀lọpọ̀ metabolites. Àròpọ̀ àwọn ìwọ̀n mẹ́ta fún irú ìdàgbàsókè kọ̀ọ̀kan ± SE. Ìlà grẹ́y náà dúró fún ìbáṣepọ̀ 1:1. Ìbáṣepọ̀ intra-class (ICC) ti àwọn ìwọ̀n tí a tún fihàn nínú àmì axis. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Àwòrán onípele ti ìṣiṣẹ́ ti ìwádìí metabolite alaisan. A kó àwọn ascites tàbí èèmọ́ jọ láti ọ̀dọ̀ àwọn aláìsàn àti cryopreserved. A ṣe àyẹ̀wò apá kékeré ti àpẹẹrẹ kọ̀ọ̀kan nípa lílo flow cytometry, nígbà tí àwọn àpẹẹrẹ tí ó kù ṣe ìpele mẹ́ta ti ìdàgbàsókè fún àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4+, CD8+ àti CD45-. A ṣe àyẹ̀wò àwọn ìpín sẹ́ẹ̀lì wọ̀nyí nípa lílo LC-MS/MS. (D) Àwòrán ooru ti ìdàgbàsókè metabolite tí a ṣe déédéé. Dendrogram dúró fún ìṣọ̀kan Ward ti àwọn ijinna Euclidean láàrín àwọn àpẹẹrẹ. (E) Ìṣàyẹ̀wò èròjà pàtàkì (PCA) ti àwòrán metabolite àpẹẹrẹ, tí ó ń fi àwọn àpẹẹrẹ mẹ́ta ti àpẹẹrẹ kọ̀ọ̀kan hàn, àwọn àpẹẹrẹ láti ọ̀dọ̀ aláìsàn kan náà ni a so pọ̀ mọ́ ìlà kan. (F) PCA ti ìṣàfihàn metabolite ti àpẹẹrẹ tí a fi sí ara aláìsàn (ìyẹn ni, nípa lílo ìpín díẹ̀); irú àpẹẹrẹ náà ní ààlà pẹ̀lú convex hull. PC1, pàtàkì èròjà 1; PC2, pàtàkì èròjà 2.
Lẹ́yìn náà, a lo ọ̀nà ìdàgbàsókè yìí láti ṣe àyẹ̀wò àwọn metabolites 99 nínú àwọn ìpín sẹ́ẹ̀lì CD4 +, CD8 + àti CD45 nínú àwọn ascites àti èèmọ́ àwọn aláìsàn HGSC mẹ́fà (Àwòrán 2C, Àwòrán S3A àti Táblì S3 àti S4). Iye àwọn tí ó ní ìfẹ́ sí jẹ́ 2% sí 70% ti àpẹẹrẹ ńlá ti àwọn sẹ́ẹ̀lì alààyè àtilẹ̀wá, àti pé ìpín àwọn sẹ́ẹ̀lì yàtọ̀ síra gidigidi láàárín àwọn aláìsàn. Lẹ́yìn yíya àwọn ìlẹ̀kẹ̀ sọ́tọ̀, ìpín tí ó ní ìfẹ́ sí (CD4+, CD8+ tàbí CD45-) jẹ́ fún ju 85% gbogbo àwọn sẹ́ẹ̀lì alààyè nínú àyẹ̀wò náà ní àròpín. Ọ̀nà ìdàgbàsókè yìí gbà wá láàyè láti ṣe àyẹ̀wò àwọn ènìyàn láti inú ìṣẹ̀dá àsopọ èèmọ́ ènìyàn, èyí tí kò ṣeé ṣe láti ṣe láti inú àwọn àyẹ̀wò ńlá. Nípa lílo ìlànà yìí, a pinnu pé l-kynurenine àti adenosine, àwọn metabolites immunosuppressive méjì wọ̀nyí tí a ṣe àfihàn dáradára ni a gbé ga nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T tumor tàbí àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor (Àwòrán S3, B àti C). Nítorí náà, àwọn àbájáde wọ̀nyí fi ìdúróṣinṣin àti agbára ti ìyàsọ́tọ̀ sẹ́ẹ̀lì wa àti ìmọ̀-ẹ̀rọ mass spectrometry láti rí àwọn metabolites pàtàkì nínú àwọn àsopọ aláìsàn.
Àyẹ̀wò wa tún fi ìyàtọ̀ tó lágbára hàn láàárín àwọn irú sẹ́ẹ̀lì láàárín àti láàárín àwọn aláìsàn (Àwòrán 2D àti Àwòrán S4A). Ní ​​pàtàkì, ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn aláìsàn mìíràn, aláìsàn 70 fi àwọn ànímọ́ ìṣètò ara tó yàtọ̀ hàn (Àwòrán 2E àti Àwòrán S4B), èyí tó fi hàn pé ó ṣeé ṣe kí ìyàtọ̀ ara tó pọ̀ wà láàárín àwọn aláìsàn. Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn aláìsàn mìíràn (lítà 1.2 sí 2; Táblì S1), iye gbogbo ascites tí a kó jọ nínú aláìsàn 70 (80 milimita) kéré sí i. Ìṣàkóso ìyàtọ̀ ara láàárín àwọn aláìsàn nígbà ìṣàyẹ̀wò èròjà pàtàkì (fún àpẹẹrẹ, nípa lílo ìṣàyẹ̀wò ìpín díẹ̀) fi àwọn ìyípadà tó wọ́pọ̀ hàn láàrín àwọn irú sẹ́ẹ̀lì, àti pé àwọn irú sẹ́ẹ̀lì àti/tàbí àyíká ara ni a kó jọ ní kedere gẹ́gẹ́ bí ìṣàfihàn metabolite (Àwòrán 2F). Ìṣàyẹ̀wò àwọn metabolite kan ṣoṣo tẹnu mọ́ àwọn ipa wọ̀nyí, ó sì fi àwọn ìyàtọ̀ pàtàkì hàn láàrín àwọn irú sẹ́ẹ̀lì àti àyíká ara. Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé ìyàtọ̀ tó ga jùlọ tí a rí ni MNA, èyí tí a sábà máa ń fi kún àwọn sẹ́ẹ̀lì CD45 àti nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4+ àti CD8+ tí ó wọ inú èèmọ́ náà (Àwòrán 3A). Fún àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4+, ipa yìí hàn gbangba jùlọ, àti pé MNA nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì CD8+ náà dàbí ẹni pé àyíká ní ipa gidigidi lórí. Síbẹ̀síbẹ̀, èyí kò ṣe pàtàkì, nítorí pé mẹ́ta nínú àwọn aláìsàn mẹ́fà nìkan ni a lè ṣe àyẹ̀wò fún àwọn àmì àrùn CD8+ tumor. Ní àfikún sí MNA, nínú onírúurú sẹ́ẹ̀lì nínú ascites àti tumor, àwọn metabolites mìíràn tí a kò fi hàn dáadáa nínú TIL tún ní ọ̀pọ̀lọpọ̀ ọrọ̀ (Àwòrán S3 àti S4). Nítorí náà, àwọn dátà wọ̀nyí fi àkójọ àwọn metabolites immunomodulatory tó dájú hàn fún ìwádìí síwájú sí i.
(A) Àkóónú MNA tí a ṣe déédé nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4+, CD8+ àti CD45- láti inú ascites àti tumor. Àwòrán àpótí náà fi àárín (ìlà), interquartile range (frame hinge) àti data range hàn, tó ìlọ́po 1.5 interquartile range (frame whisker). Gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ nínú Àwọn Ohun èlò àti Ọ̀nà Àìsàn, lo iye limma ti aláìsàn láti pinnu iye P (*P<0.05 àti **P<0.01). (B) Àwòrán onípele ti MNA metabolism (60). Metabolites: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Àwọn ẹ́ńsáímù (aláwọ̀ ewé): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE ti scRNA-seq ti ascites (grẹy) ati tumor (pupa; n = awọn alaisan 3). (D) Ifihan NNMT ninu awọn olugbe sẹẹli oriṣiriṣi ti a mọ nipa lilo scRNA-seq. (E) Ifihan NNMT ati AOX1 ninu SK-OV-3, kidinrin ọmọ inu oyun eniyan (HEK) 293T, awọn sẹẹli T ati awọn sẹẹli T ti a tọju MNA. Ifihan ti a ti so pọ ni a fihan ni ibatan si SK-OV-3. A fihan apẹẹrẹ ifihan pẹlu SEM (n = awọn olufunni ilera 6). Awọn iye Ct ti o tobi ju 35 lọ ni a ko le rii (UD). (F) Ìfarahàn SLC22A1 àti SLC22A2 nínú SK-OV-3, HEK293T, àwọn sẹ́ẹ̀lì T àti àwọn sẹ́ẹ̀lì T tí a fi 8mM MNA tọ́jú. Ìfarahàn tí a tẹ̀ pọ̀ hàn ní ìbámu pẹ̀lú SK-OV-3. Ìfarahàn ìfarahàn pẹ̀lú SEM hàn (n = 6 àwọn olùfúnni ní ìlera). Àwọn iye Ct tí ó ju 35 lọ ni a kà sí àìṣeérí (UD). (G) Àkóónú MNA sẹ́ẹ̀lì nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T olùfúnni ní ìlera tí a ti mú ṣiṣẹ́ lẹ́yìn wákàtí 72 ti ìfàmọ́ra pẹ̀lú MNA. Ìfarahàn ìfarahàn pẹ̀lú SEM hàn (n = 4 àwọn olùfúnni ní ìlera).
A ṣe MNA nípa gbígbé ẹgbẹ́ methyl láti S-adenosyl-1-methionine (SAM) sí nicotinamide (NA) nípasẹ̀ nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Àwòrán 3B). NNMT ní ìfarahàn púpọ̀ nínú onírúurú àrùn jẹjẹrẹ ènìyàn, ó sì ní í ṣe pẹ̀lú ìbísí, ìkọlù àti ìfarahàn (25-27). Láti lóye orísun MNA nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T nínú TME dáadáa, a lo scRNA-seq láti ṣe àpèjúwe ìfarahàn NNMT láàárín àwọn irú sẹ́ẹ̀lì nínú àwọn ascites àti àwọn èèmọ́ àwọn aláìsàn HGSC mẹ́ta (Àtẹ S5). Ìṣàyẹ̀wò àwọn sẹ́ẹ̀lì tó tó 6,500 fihàn pé nínú àwọn àyíká ascites àti èèmọ́, ìfarahàn NNMT ní ààlà sí àwọn ènìyàn fibroblast àti èèmọ́ tí a rò pé wọ́n ní (Àwòrán 3, C àti D). Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé kò sí ìfarahàn NNMT tó hàn gbangba nínú èyíkéyìí àwùjọ tí ó ń ṣe àfihàn PTPRC (CD45 +) (Àwòrán 3D àti Àwòrán S5A), èyí tí ó fihàn pé a ti fi MNA tí a rí nínú ìrísí metabolite sínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T. Ìfarahàn aldehyde oxidase 1 (AOX1) yí MNA padà sí 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) tàbí 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR); Àwòrán 3B) tún wà ní ààlà sí iye àwọn fibroblasts tí ń ṣàfihàn COL1A1 (Àwòrán S5A), èyí tí ó fihàn pé àwọn sẹ́ẹ̀lì T kò ní agbára ìṣiṣẹ́ MNA àtọwọ́dá. A fi ìdí ìfarahàn àwọn jínì tí ó ní í ṣe pẹ̀lú MNA yìí múlẹ̀ nípa lílo ìtòjọ data sẹ́ẹ̀lì aláìdádúró kejì láti inú ascites láti ọ̀dọ̀ àwọn aláìsàn HGSC (Àwòrán S5B; n = 6) (16). Ní ​​àfikún, ìṣàyẹ̀wò quantitative polymerase chain reaction (qPCR) ti àwọn sẹ́ẹ̀lì T olùfúnni ní ìlera tí a fi MNA tọ́jú fihàn pé a kò tíì fi hàn ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor ovarian SK-OV-3, NNMT tàbí AOX1 (Àwòrán 3E). Àwọn àbájáde àìròtẹ́lẹ̀ wọ̀nyí fihàn pé MNA lè jáde láti inú fibroblasts tàbí tumors sínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T tí ó wà nítòsí nínú TME.
Bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn olùdíje ní ìdílé àwọn olùgbé cation organic 1 sí 3 (OCT1, OCT2 àti OCT3) tí ìdílé olùgbé 22 (SLC22) tí ó ní omi (SLC22A1, SLC22A2 àti SLC22A3) ti yàn, àwọn olùgbé MNA tí ó ṣeé ṣe kò tí ì ṣe àlàyé (28). QPCR ti mRNA láti inú àwọn sẹ́ẹ̀lì T olùfúnni ní ìlera fi ìpele ìfarahàn SLC22A1 tí ó kéré hàn ṣùgbọ́n tí a kò lè rí i ti SLC22A2, èyí tí ó fìdí rẹ̀ múlẹ̀ pé a ti ròyìn rẹ̀ tẹ́lẹ̀ nínú ìwé (Àwòrán 3F) (29). Ní ​​ìyàtọ̀ sí èyí, ìlà sẹ́ẹ̀lì àrùn jẹjẹrẹ ovarian SK-OV-3 fi ìpele gíga ti àwọn olùgbé méjèèjì hàn (Àwòrán 3F).
Láti lè dán ìṣeéṣe pé àwọn sẹ́ẹ̀lì T ní agbára láti gba MNA àjèjì, a gbin àwọn sẹ́ẹ̀lì T olùfúnni tí ó ní ìlera fún wákàtí 72 ní iwájú àwọn ìṣọ̀kan MNA tí ó yàtọ̀ síra. Ní àìsí MNA exogenous, a kò le rí akoonu sẹ́ẹ̀lì MNA (Àwòrán 3G). Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn sẹ́ẹ̀lì T tí a mú ṣiṣẹ́ tí a fi MNA exogenous tọ́jú fi ìbísí tí ó sinmi lórí ìwọ̀n nínú akoonu MNA nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì náà hàn, títí dé 6 mM MNA (Àwòrán 3G). Àbájáde yìí fihàn pé láìka ìpele ìfarahàn olùgbé àti àìsí enzyme pàtàkì tí ó ń ṣe àkóso ìṣiṣẹ́ MNA nínú ara, TIL ṣì le gba MNA.
Àwòrán àwọn metabolites nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T àwọn aláìsàn àti àwọn àyẹ̀wò ìfàmọ́ra MNA nínú vitro mú kí ó ṣeéṣe kí àwọn fibroblasts tí ó níí ṣe pẹ̀lú àrùn jẹjẹrẹ (CAF) tú MNA jáde, àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor sì lè ṣàkóso ìrísí àti iṣẹ́ TIL. Láti mọ ipa tí MNA ní lórí àwọn sẹ́ẹ̀lì T, a mú àwọn sẹ́ẹ̀lì T olùfúnni tí ó ní ìlera ṣiṣẹ́ nínú vitro nígbà tí MNA bá wà tàbí láìsí, a sì ṣe àyẹ̀wò ìbísí wọn àti ìṣelọ́pọ́ cytokine wọn. Lẹ́yìn ọjọ́ méje tí a fi MNA kún ní ìwọ̀n tí ó ga jùlọ, iye ènìyàn tí ó pọ̀ sí i dínkù díẹ̀, nígbà tí a ń pa agbára mọ́ ní gbogbo ìwọ̀n (Àwòrán 4A). Ní ​​àfikún, ìtọ́jú MNA tí ó jáde láti inú ara yọrí sí ìbísí nínú ìpín àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + àti CD8 + T tí ó ń fihàn tumor necrosis factor-α (TNFα; Àwòrán 4B). Ní ​​ìyàtọ̀ sí èyí, ìṣelọ́pọ́ inú ara ti IFN-γ dínkù gidigidi nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + T, ṣùgbọ́n kìí ṣe nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì CD8 + T, kò sì sí ìyípadà pàtàkì nínú interleukin 2 (IL-2; Àwòrán 4, C àti D). Nítorí náà, àyẹ̀wò ìfàmọ́ra-ẹ̀mí-ara-ẹni-láti inú àwọn àgbẹ̀ T tí a fi MNA tọ́jú yìí fi ìbísí pàtàkì hàn nínú TNFα, ìdínkù nínú IFN-γ, àti pé kò sí ìyípadà nínú IL-2 (Àwòrán 4, E sí G). . Ìdínkù IFN-γ fihàn pé MNA lè kó ipa nínú dídínà ìṣiṣẹ́ ìdènà-ẹ̀mí-ara-ẹni ti àwọn sẹ́ẹ̀lì T. Láti lè ṣe àfarawé ipa MNA lórí cytotoxicity tí a fi sẹ́ẹ̀lì T ṣe, àwọn sẹ́ẹ̀lì chimeric antigen receptor T (FRα-CAR-T) tí ó ń fojúsùn folate receptor α àti CAR-T (GFP) tí a ń ṣàkóso nípasẹ̀ àwọn sẹ́ẹ̀lì mononuclear blood donor peripheral blood donor (GFP) -CAR-T) ni a ń ṣe láti ọwọ́ àwọn sẹ́ẹ̀lì CAR-T tí ó ní ìlera fún wákàtí 24 ní iwájú MNA, lẹ́yìn náà a ń ṣe àgbékalẹ̀ wọn pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì SK-OV-3 ti ènìyàn tí ó ń ṣàfihàn folate receptor α ní ìpíndọ́gba ìfàmọ́ra sí àfojúsùn ti 10:1. Ìtọ́jú MNA yọrí sí ìdínkù pàtàkì nínú iṣẹ́ pípa àwọn sẹ́ẹ̀lì FRα-CAR-T, èyí tí ó jọ àwọn sẹ́ẹ̀lì FRα-CAR-T tí a fi adenosine tọ́jú (Àwòrán 4H).
(A) Iye gbogbo awọn sẹẹli ti o le ṣe ati ilọpo meji olugbe (PD) taara lati asa ni ọjọ 7. Àwòrán àtẹ naa duro fun apapọ + SEM ti awọn olufunni ilera mẹfa. O duro fun data lati o kere ju n = awọn idanwo ominira mẹta. (B si D) CD3/CD28 ati IL-2 ni a lo lati mu awọn sẹẹli T ṣiṣẹ ni awọn ifọkansi MNA wọn fun ọjọ 7. Ṣaaju itupalẹ, a mu awọn sẹẹli ṣiṣẹ pẹlu PMA/ionomycin pẹlu GolgiStop fun wakati 4. Ifihan TNFα (B) ninu awọn sẹẹli T. Apẹẹrẹ aworan (osi) ati data tabular (ọtun) ti ifihan TNFα ninu awọn sẹẹli alãye. Ifihan IFN-γ (C) ati IL-2 (D) ninu awọn sẹẹli T. A wọn ifihan cytokines nipasẹ cytometry sisan. Àwòrán àtẹ naa duro fun apapọ (n = awọn olufunni ilera 6) + SEM. Lo itupalẹ ọna kan ti iyatọ ati awọn wiwọn ti a tun ṣe (*P<0.05 ati **P<0.01) lati pinnu iye P. O duro fun data lati o kere ju awọn idanwo ominira n = 3. (E sí G) ni a lo CD3/CD28 àti IL-2 láti mu àwọn sẹ́ẹ̀lì T ṣiṣẹ́ ní ìwọ̀n MNA wọn fún ọjọ́ méje. A kó ìwọ̀n náà jọ ṣáájú àti lẹ́yìn wákàtí mẹ́rin ti ìfúnni PMA/ionomycin. A wọn ìwọ̀n TNFα (E), IFN-γ (F) àti IL-2 (G) nípa ELISA. Àwòrán ọ̀pá náà dúró fún àròpín (n = 5 àwọn olùfúnni ní ìlera) + SEM. A pinnu iye P nípa lílo ìṣàyẹ̀wò ìyàtọ̀ ọ̀nà kan àti àwọn ìwọ̀n tí a tún ṣe (*P<0.05). Ìlà àmì náà fi ààlà ìwárí hàn. (H) Ìdánwò lysis sẹ́ẹ̀lì. A ṣe àtúnṣe àwọn sẹ́ẹ̀lì FRα-CAR-T tàbí GFP-CAR-T pẹ̀lú adenosine (250μM) tàbí MNA (10 mM) fún wákàtí 24, tàbí kí a fi sílẹ̀ láìtọ́jú (Ctrl). A wọn ìpín ogorun ìpakúpa àwọn sẹ́ẹ̀lì SK-OV-3. A pinnu iye P nípasẹ̀ ìdánwò Welch t (*P<0.5 àti **P<0.01).
Láti lè ní òye ẹ̀rọ nípa ìlànà ìṣàfihàn TNFα tí ó gbẹ́kẹ̀lé MNA, a ṣe àyẹ̀wò àwọn àyípadà nínú TNFα mRNA ti àwọn sẹ́ẹ̀lì T tí a tọ́jú MNA (Àwòrán 5A). Àwọn sẹ́ẹ̀lì T olùfúnni tí ó ní ìlera tí a tọ́jú pẹ̀lú MNA fi ìbísí méjì hàn nínú àwọn ìpele ìkọ̀wé TNFα, tí ó fihàn pé MNA gbára lé ìlànà ìkọ̀wé TNFα. Láti ṣe ìwádìí lórí ìlànà ìṣètò yìí, a ṣe àyẹ̀wò àwọn ohun ìkọ̀wé méjì tí a mọ̀ tí ó ń ṣe àkóso TNFα, èyí tí a ń pè ní T cell nuclear factor (NFAT) tí a ṣiṣẹ́ àti prótéènì pàtó 1 (Sp1), ní ìdáhùn sí ìsopọ̀ MNA sí olùpèsè TNFα tí ó súnmọ́ (30). Olùpèsè TNFα ní àwọn ibi ìsopọ̀ NFAT mẹ́fà tí a ti dámọ̀ àti àwọn ibi ìsopọ̀ Sp1 méjì, tí ó ń wọ́pọ̀ ní ibi kan [-55 base pairs (bp) láti 5'cap] (30). Chromatin immunoprecipitation (ChIP) fihàn pé nígbà tí a bá fi MNA tọ́jú rẹ̀, ìsopọ̀ Sp1 sí olùpèsè TNFα pọ̀ sí i ní ìlọ́po mẹ́ta. Ìsopọ̀ NFAT náà tún pọ̀ sí i ó sì sún mọ́ pàtàkì (Àwòrán 5B). Àwọn ìwádìí wọ̀nyí fihàn pé MNA ń ṣàkóso ìgbékalẹ̀ TNFα nípasẹ̀ ìkọ̀wé Sp1, àti dé ìwọ̀n díẹ̀ nínú ìgbékalẹ̀ NFAT.
(A) Ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì T tí a gbìn láìsí MNA, ìyípadà ìfọ́pọ̀ ìfọ́pọ̀ ìfọ́pọ̀ TNFα nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T tí a fi MNA tọ́jú. A fi àpẹẹrẹ ìfọ́pọ̀ ìfọ́pọ̀ pẹ̀lú SEM hàn (n = 5 àwọn olùfúnni ní ìlera). Ó dúró fún dátà láti inú ó kéré tán n = 3 àwọn ìwádìí aláìdádúró. (B) Olùgbékalẹ̀ TNFα ti àwọn sẹ́ẹ̀lì T tí a tọ́jú pẹ̀lú tàbí láìsí 8 mM MNA lẹ́yìn NFAT àti Sp1 ni a so pọ̀ mọ́ (Ctrl) àti ìfúnni PMA/ionomycin fún wákàtí mẹ́rin. A lo Immunoglobulin G (IgG) àti H3 gẹ́gẹ́ bí àwọn ìṣàkóso odi àti rere fún ìdènà ìdènà, lẹ́sẹẹsẹ. Ìwọ̀n ChIP fihàn pé ìsopọ̀ Sp1 àti NFAT sí olùgbékalẹ̀ TNFα nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a tọ́jú MNA pọ̀ sí i ní ìgbà púpọ̀ ní ìfiwéra pẹ̀lú ìṣàkóso. Ó dúró fún dátà láti inú àwọn ìwádìí aláìdádúró n = 3. Iye P tí a pinnu nípasẹ̀ ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ìdánwò t (*** P <0.01). (C) Ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ascites ti HGSC, àwọn sẹ́ẹ̀lì T (tí kì í ṣe cytotoxic) fi ìfọ́pọ̀ TNF hàn nínú àrùn náà. Àwọn àwọ̀ náà dúró fún àwọn aláìsàn tó yàtọ̀ síra. A ti ṣe àyẹ̀wò àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a fihàn láìròtẹ́lẹ̀ sí 300, a sì ti yí wọn padà láti dín ìfàsẹ́yìn kù (** Padj = 0.0076). (D) Àpẹẹrẹ MNA tí a dámọ̀ràn fún àrùn jẹjẹrẹ ọmú. A ń ṣe MNA nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor àti fibroblasts nínú TME, àwọn sẹ́ẹ̀lì T sì ń gbà á. MNA ń mú kí ìsopọ̀ Sp1 pọ̀ sí olùgbékalẹ̀ TNFα, èyí tí ó ń yọrí sí ìkọsílẹ̀ TNFα àti ìṣẹ̀dá cytokine TNFα pọ̀ sí i. MNA tún ń fa ìdínkù nínú IFN-γ. Ìdènà iṣẹ́ sẹ́ẹ̀lì T ń yọrí sí ìdínkù agbára pípa àti ìdàgbàsókè àrùn jẹjẹrẹ.
Gẹ́gẹ́ bí ìròyìn ṣe sọ, TNFα ní ipa ìdènà àrùn jẹjẹrẹ àti ìdènà àrùn jẹjẹrẹ tí ó dúró ṣinṣin níwájú àti ẹ̀yìn, ṣùgbọ́n ó ní ipa tí a mọ̀ dáadáa nínú gbígbé ìdàgbàsókè àti ìdàgbàsókè àrùn jẹjẹrẹ ọmú (31-33). Gẹ́gẹ́ bí ìròyìn ṣe sọ, ìpele TNFα nínú àwọn àsopọ̀ àrùn jẹjẹrẹ ọmú nínú àwọn aláìsàn tí wọ́n ní àrùn jẹjẹrẹ ọmú ga ju ti àwọn àsopọ̀ àrùn jẹjẹrẹ ọmú lọ (34-36). Ní ​​ti ètò ìṣiṣẹ́, TNFα lè ṣe àkóso ìṣiṣẹ́, iṣẹ́ àti ìbísí àwọn sẹ́ẹ̀lì ẹ̀jẹ̀ funfun, kí ó sì yí ìrísí àwọn sẹ́ẹ̀lì àrùn jẹjẹrẹ padà (37, 38). Ní ​​ìbámu pẹ̀lú àwọn àwárí wọ̀nyí, ìṣàyẹ̀wò ìṣàfihàn ìran ọ̀mú fihàn pé TNF ti pọ̀ sí i ní àwọn sẹ́ẹ̀lì T nínú àwọn àsopọ̀ àrùn jẹjẹrẹ ní ìfiwéra pẹ̀lú ascites (Àwòrán 5C). Ìbísí nínú ìṣàfihàn TNF hàn gbangba nínú àwọn ènìyàn T cell pẹ̀lú ìrísí àrùn jẹjẹrẹ tí kì í ṣe cytotoxic (Àwòrán S5A). Ní ​​àkótán, àwọn dátà wọ̀nyí ṣe àtìlẹ́yìn fún èrò náà pé MNA ní àwọn ipa ìdènà àrùn jẹjẹrẹ méjì àti ìdàgbàsókè àrùn jẹjẹrẹ nínú HGSC.
Àmì Fluorescent tí a gbé ka orí ìṣàn cytometry ti di ọ̀nà pàtàkì fún kíkẹ́kọ̀ọ́ nípa ìṣiṣẹ́ TIL. Àwọn ìwádìí wọ̀nyí ti fihàn pé ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn lymphocytes ẹ̀jẹ̀ àgbékalẹ̀ tàbí àwọn sẹ́ẹ̀lì T láti inú àwọn ẹ̀yà ara lymphoid kejì, murine àti TIL ènìyàn ní ìtẹ̀sí gíga láti gba glucose (4, 39) àti pípadánù iṣẹ́ mitochondrial díẹ̀díẹ̀ (19, 40). Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a ti rí àwọn àbájáde kan náà nínú ìwádìí yìí, ìdàgbàsókè pàtàkì ni láti fi ìṣiṣẹ́ àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor àti TIL wé ara wọn láti inú àsopọ tumor kan náà tí a ti yà sọ́tọ̀. Gẹ́gẹ́ bí díẹ̀ nínú àwọn ìròyìn ìṣáájú wọ̀nyí, àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor (CD45-EpCAM +) láti inú ascites àti tumor ní ìṣiṣẹ́ glucose gíga ju àwọn sẹ́ẹ̀lì CD8 + àti CD4 + T lọ, èyí tí ó ń ṣètìlẹ́yìn pé ìṣiṣẹ́ glucose gíga ti àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor ni a lè fi wé àwọn sẹ́ẹ̀lì T. Èrò ti ìdíje sẹ́ẹ̀lì T. TME. Síbẹ̀síbẹ̀, ìṣiṣẹ́ mitochondrial ti àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor ga ju ti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD8 + T lọ, ṣùgbọ́n ìṣiṣẹ́ mitochondrial jọ ti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + T. Àwọn àbájáde wọ̀nyí ń fi kún kókó tí ó ń yọjú pé ìṣiṣẹ́ oxidative ṣe pàtàkì fún àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor (41, 42). Wọ́n tún dámọ̀ràn pé àwọn sẹ́ẹ̀lì CD8 + T lè ní ìṣòro àìṣiṣẹ́ oxidative ju àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + T lọ, tàbí pé àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + T lè lo àwọn orísun erogba yàtọ̀ sí glucose láti mú kí iṣẹ́ mitochondrial ṣiṣẹ́ (43, 44). Ó yẹ kí a kíyèsí pé a kò rí ìyàtọ̀ kankan nínú gbígba glucose tàbí iṣẹ́ mitochondrial láàrín àwọn olùṣe CD4 + T, ìrántí T effector àti àwọn sẹ́ẹ̀lì ìrántí T central nínú ascites. Bákan náà, ipò ìyàtọ̀ ti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD8 + T nínú àwọn èèmọ́ kò níí ṣe pẹ̀lú àwọn ìyípadà nínú gbígba glucose, èyí tí ó ń fi ìyàtọ̀ pàtàkì hàn láàrín àwọn sẹ́ẹ̀lì T tí a gbin nínú vitro àti TIL ènìyàn nínú vivo (22). Àwọn àkíyèsí wọ̀nyí ni a tún fìdí rẹ̀ múlẹ̀ nípa lílo ìpínkiri iye àwọn sẹ́ẹ̀lì aládàáṣe tí kò ní ẹ̀tanú, èyí tí ó tún fi hàn pé àwọn sẹ́ẹ̀lì CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + tí wọ́n ní gbígba glucose gíga àti iṣẹ́ mitochondrial ju àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor lọ wọ́pọ̀ ṣùgbọ́n wọ́n ní iye àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ń ṣiṣẹ́ nínú Metabolic. Àwọn ènìyàn yìí lè ṣojú fún ìpínkiri àwọn sẹ́ẹ̀lì ìdènà myeloid tàbí àwọn sẹ́ẹ̀lì dendritic plasmacytoid tí a dámọ̀ nínú ìwádìí scRNA-seq. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a ti ròyìn àwọn méjèèjì nínú àwọn èèmọ́ ara ọmọ ènìyàn [45], wọ́n ṣì nílò iṣẹ́ síwájú sí i láti ṣàlàyé ìpínkiri myeloid yìí.
Bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn ọ̀nà tí a fi ń lo ìṣàn sẹ́ẹ̀lì lè ṣàlàyé ìyàtọ̀ gbogbogbòò nínú gúúsì àti ìṣiṣẹ́ sẹ́ẹ̀lì láàárín àwọn irú sẹ́ẹ̀lì, a kò tíì mọ àwọn metabolites pàtó tí glucose tàbí àwọn orísun erogba míràn ṣe fún ìṣiṣẹ́ mitochondrial nínú TME. Fífi wíwà tàbí àìsí àwọn metabolites sí apá TIL kan nílò ìwẹ̀nùmọ́ iye sẹ́ẹ̀lì láti inú àsopọ tí a yọ kúrò. Nítorí náà, ọ̀nà ìdàgbàsókè sẹ́ẹ̀lì wa tí a so pọ̀ mọ́ mass spectrometry lè fúnni ní òye nípa àwọn metabolites tí a fi onírúurú kún nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T àti àwọn iye sẹ́ẹ̀lì tumor nínú àwọn àpẹẹrẹ aláìsàn tí ó báramu. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ọ̀nà yìí ní àwọn àǹfààní ju ìṣàtúnṣe sẹ́ẹ̀lì tí a ń mú fluorescence ṣiṣẹ́ lọ, àwọn ibi ìkàwé metabolite kan lè ní ipa lórí nítorí ìdúróṣinṣin àti/tàbí ìwọ̀n ìyípadà kíákíá (22). Síbẹ̀síbẹ̀, ọ̀nà wa lè dá àwọn metabolites immunosuppressive méjì tí a mọ̀ mọ̀, adenosine àti kynurenine, nítorí wọ́n yàtọ̀ síra gidigidi láàárín àwọn irú àpẹẹrẹ.
Àgbéyẹ̀wò wa nípa àwọn èèmọ́ àti àwọn ẹ̀yà TIL fún wa ní òye púpọ̀ sí i nípa ipa tí àwọn metabolites ní nínú TME ti ovarian. Àkọ́kọ́, nípa lílo ìṣàn cytometry, a pinnu pé kò sí ìyàtọ̀ nínú iṣẹ́ mitochondrial láàrín èèmọ́ àti àwọn sẹ́ẹ̀lì CD4 + T. Síbẹ̀síbẹ̀, àgbéyẹ̀wò LC-MS/MS fi àwọn ìyípadà pàtàkì hàn nínú ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn metabolites láàrín àwọn ènìyàn wọ̀nyí, tí ó fihàn pé àwọn ìparí nípa ìṣàn TIL àti ìṣiṣẹ́ ìṣàn rẹ̀ lápapọ̀ nílò ìtumọ̀ tí ó ṣọ́ra. Èkejì, MNA ni metabolite pẹ̀lú ìyàtọ̀ tí ó ga jùlọ láàrín àwọn sẹ́ẹ̀lì CD45 àti àwọn sẹ́ẹ̀lì T nínú ascites, kìí ṣe èèmọ́. Nítorí náà, ìpínkiri àti ipò èèmọ́ le ní àwọn ipa ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ lórí ìṣàn TIL, èyí tí ó ṣe àfihàn ìyàtọ̀ tí ó ṣeé ṣe nínú àyíká kékeré kan. Ẹ̀kẹta, ìfihàn enzyme tí ń ṣe MNA NNMT ní ààlà sí CAF, èyí tí ó jẹ́ àwọn sẹ́ẹ̀lì èèmọ́ sí ìwọ̀n díẹ̀, ṣùgbọ́n a rí àwọn ipele MNA tí a lè ṣàwárí nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T tí a ti yọ èèmọ́. Ìṣàn NNMT jù nínú CAF ti ovarian ní ipa tí ó ń mú àrùn jẹjẹrẹ wá, ní apá kan nítorí ìgbéga ìṣàn CAF, ìkọlù èèmọ́ àti metastasis (27). Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ìpele gbogbogbòò ti TIL jẹ́ ìwọ̀nba, ìfarahàn NNMT nínú CAF ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú irú abẹ́rẹ́ mesenchymal Cancer Genome Atlas (TCGA), èyí tí ó ní í ṣe pẹ̀lú àsọtẹ́lẹ̀ tí kò dára (27, 46, 47). Níkẹyìn, ìfarahàn enzyme AOX1 tí ó fa ìbàjẹ́ MNA tún ní ààlà sí iye àwọn ènìyàn CAF, èyí tí ó fihàn pé àwọn sẹ́ẹ̀lì T kò ní agbára láti mú MNA ṣiṣẹ́ pọ̀. Àwọn àbájáde wọ̀nyí ṣe àtìlẹ́yìn fún èrò náà pé bó tilẹ̀ jẹ́ pé a nílò iṣẹ́ síwájú sí i láti fìdí àwárí yìí múlẹ̀, ìwọ̀n gíga ti MNA nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T lè fihàn wíwà àyíká CAF tí ó ń dín agbára ìdènà kù.
Nítorí ìpele ìfarahàn kékeré ti àwọn agbérò MNA àti ìpele tí a kò lè rí ti àwọn amuaradagba pàtàkì tí ó ní ipa nínú ìṣiṣẹ́ MNA, wíwà MNA nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T kò ṣeé retí. A kò le ṣàwárí NNMT tàbí AOX1 nípasẹ̀ ìwádìí scRNA-seq àti ìfọkànsí qPCR ti àwọn ẹgbẹ́ méjì tí ó dá dúró. Àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé àwọn sẹ́ẹ̀lì T kì í ṣe àwọn sẹ́ẹ̀lì T ló ṣe MNA, ṣùgbọ́n wọ́n gbà á láti inú TME tí ó yí i ká. Àwọn àyẹ̀wò In vitro fihàn pé àwọn sẹ́ẹ̀lì T sábà máa ń kó MNA tí ó wà níta jọ.
Àwọn ìwádìí in vitro wa ti fihàn pé MNA exogenous ń fa ìfarahàn TNFα nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì T ó sì ń mú kí ìsopọ̀ Sp1 pọ̀ sí olùgbékalẹ̀ TNFα. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé TNFα ní iṣẹ́ ìdènà-àrùn àti ìdènà-àrùn, nínú àrùn jẹjẹrẹ ovarian, TNFα lè mú ìdàgbàsókè àrùn jẹjẹrẹ ovarian (31-33). Ìdènà TNFα nínú àṣà ìṣẹ̀dá sẹ́ẹ̀lì èèmọ́ ovarian tàbí ìdènà àmì TNFα nínú àwọn àpẹẹrẹ eku lè mú ìṣẹ̀dá cytokine ìgbóná-ọkàn tí TNFα ṣe sunwọ̀n síi kí ó sì dín ìdàgbàsókè èèmọ́ kù (32, 35). Nítorí náà, nínú ọ̀ràn yìí, MNA tí TME ti yọrí sí le ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí metabolite pro-inflammatory nípasẹ̀ ẹ̀rọ tí ó gbẹ́kẹ̀lé TNFα nípasẹ̀ autocrine lupu, nípa bẹ́ẹ̀ ó ń mú ìṣẹ̀lẹ̀ àti ìtànkálẹ̀ àrùn jẹjẹrẹ ovarian pọ̀ síi (31). Nítorí èyí, a ń ṣe ìwádìí nípa ìdènà TNFα gẹ́gẹ́ bí ohun tí ó lè ṣe ìtọ́jú fún àrùn jẹjẹrẹ ovarian (37, 48, 49). Ní ​​àfikún, MNA ń ba ìdènà àwọn sẹ́ẹ̀lì CAR-T jẹ́ sí àwọn sẹ́ẹ̀lì èèmọ́ ovarian, ó sì ń fúnni ní ẹ̀rí síwájú síi fún ìdènà ààbò tí MNA ti ṣe. Ní àpapọ̀, àwọn àbájáde wọ̀nyí fi àpẹẹrẹ kan hàn nínú èyí tí àwọn èèmọ́ àti àwọn sẹ́ẹ̀lì CAF ti ń tú MNA jáde sínú TME tí ó wà ní ìta ara. Nípasẹ̀ (i) ìfúnni ní ìdàgbàsókè àrùn jẹjẹrẹ ẹyin tí TNF ń fà àti (ii) ìdínà ìṣiṣẹ́ cytotoxic cell tí MNA ń fà, èyí lè ní ipa èèmọ́ méjì (Àwòrán 5D).
Ní ìparí, nípa lílo àpapọ̀ ìdàgbàsókè sẹ́ẹ̀lì kíákíá, ìtẹ̀lé sẹ́ẹ̀lì kan ṣoṣo àti ìṣàfihàn ìṣẹ̀dá ara, ìwádìí yìí fi ìyàtọ̀ immunometabolomic ńlá hàn láàrín àwọn èèmọ́ àti àwọn sẹ́ẹ̀lì ascites nínú àwọn aláìsàn HGSC. Ìwádìí pípéye yìí fihàn pé àwọn ìyàtọ̀ wà nínú gbígbà glucose àti ìṣiṣẹ́ mitochondrial láàrín àwọn sẹ́ẹ̀lì T, ó sì dá MNA mọ̀ gẹ́gẹ́ bí metabolite oníṣètò ìṣètò ìṣètò ara-ẹni tí kìí ṣe sẹ́ẹ̀lì. Àwọn ìwádìí wọ̀nyí ní ipa lórí bí TME ṣe ní ipa lórí ìṣiṣẹ́ ara sẹ́ẹ̀lì T nínú àwọn àrùn jẹjẹrẹ ènìyàn. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a ti ròyìn ìdíje taara fún àwọn oúnjẹ láàárín àwọn sẹ́ẹ̀lì T àti àwọn sẹ́ẹ̀lì akàn, àwọn metabolite tún lè ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí àwọn olùṣàkóso tí kìí ṣe tààrà láti ṣe ìgbéga ìlọsíwájú àrùn jẹjẹrẹ àti bóyá láti dín àwọn ìdáhùn ìṣètò ara-ẹni tí ó wà nínú ara kù. Àpèjúwe síwájú síi nípa ipa iṣẹ́ ti àwọn metabolites ìlànà wọ̀nyí lè ṣí àwọn ọgbọ́n mìíràn sílẹ̀ fún mímú ìdáhùn ìdènà ìdènà àrùn jẹjẹrẹ pọ̀ sí i.
Àwọn àpẹẹrẹ aláìsàn àti ìwádìí ìṣègùn ni a gbà nípasẹ̀ ibi ìkópamọ́ àsopọ̀ àrùn jẹjẹrẹ BC tí Canadian Tissue Repository Network fọwọ́ sí. Gẹ́gẹ́ bí ìlànà tí BC Cancer Research Ethics Committee àti University of British Columbia (H07-00463) fọwọ́ sí, gbogbo àwọn àpẹẹrẹ aláìsàn àti ìwádìí ìṣègùn gba ìfọwọ́sowọ́pọ̀ ìkọ̀wé tàbí kí wọ́n fi ìfọwọ́sowọ́pọ̀ wọn sílẹ̀ ní tààràtà. Àwọn àpẹẹrẹ náà wà nínú BioBank tí a fọwọ́ sí (BRC-00290). Àwọn ànímọ́ aláìsàn tí a ṣàlàyé ni a fihàn nínú Táblì S1 àti S5. Fún ìfọ́mọ́ra, a lo scalpel láti fọ́ àpẹẹrẹ àrùn jẹjẹrẹ aláìsàn náà ní ẹ̀rọ, lẹ́yìn náà a tì í gba àlẹ̀mọ́ 100-micron láti gba ìdádúró sẹ́ẹ̀lì kan ṣoṣo. A fi centrifuge ascites aláìsàn náà ní 1500 rpm fún ìṣẹ́jú 10 ní 4°C láti pa àwọn sẹ́ẹ̀lì náà kí a sì yọ ohun tí ó wà nínú rẹ̀ kúrò. Àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a rí láti inú èèmọ́ àti ascites ni a fi ìpara pamọ́ sínú 50% serum ènìyàn AB tí kò ṣiṣẹ́ dáadáa (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) àti 10% dimethyl sulfoxide. Àwọn ìdènà sẹ́ẹ̀lì kan ṣoṣo tí a tọ́jú wọ̀nyí ni a yọ́, a sì lò wọ́n fún ṣíṣe àyẹ̀wò metabolomics àti metabolite tí a ṣàlàyé ní ìsàlẹ̀ yìí.
Àkójọpọ̀ pípé náà ní 0.22 μm tí a fi sẹ́ẹ̀mù AB oníná 50:50 kún: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) tí a fi 10% serum ènìyàn AB tí a kò mú ṣiṣẹ́ dáadáa kún (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x omi Penicillin Streptomycin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) àti 50 μMB-mercaptoethanol. A fi 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) àti 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) kún AimV (Invitrogen). Àkójọpọ̀ ìpara cytometer flow náà ní 0.22μm filtered phosphate buffered saline (PBS; Invitrogen) tí a fi 3% heat-inactivated AB human serum (Sigma) kún un. A fi PBS tí a ti yọ́ 0.22μm kún ohun tí ó ń mú kí sẹ́ẹ̀lì náà sunwọ̀n sí i, a sì fi serum AB ènìyàn tí kò ní agbára ooru (Sigma-Aldrich) kún un.
Ní ìwọ̀n ooru tó péye ní 37°C, a fi 10 nM MT DR àti 100 μM 2-NBDG kun àwọn sẹ́ẹ̀lì náà fún ìṣẹ́jú 30. Lẹ́yìn náà, a fi àwọ̀ eF506 tó ṣeé gbé ró ní 4°C kun àwọn sẹ́ẹ̀lì náà fún ìṣẹ́jú 15. A tún fi àwọ̀ eF506 kun àwọn sẹ́ẹ̀lì náà fún ìṣẹ́jú 15. A tún fi àwọ̀ eF506 kun àwọn sẹ́ẹ̀lì náà fún ìṣẹ́jú 15. A tún fi àwọ̀ eF506 kun àwọn sẹ́ẹ̀lì náà fún ìṣẹ́jú 15 nínú FC Block (eBioscience) àti Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), a sì fi àwọ̀ eF505 kun àwọn sẹ́ẹ̀lì náà fún ìṣẹ́jú 10 ní ìwọ̀n otútù yàrá. A fi àwọ̀ egbòogi ara (Table S2) kun àwọn sẹ́ẹ̀lì náà fún ìṣẹ́jú 4°C fún ìṣẹ́jú 20. A tún fi àwọ̀ egbòogi ara (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) kún àwọn sẹ́ẹ̀lì náà kí a tó ṣe àyẹ̀wò wọn. A lo SpectroFlo àti FlowJo V10 láti ṣe àyẹ̀wò iye àwọn sẹ́ẹ̀lì, a sì lo GraphPad Prism 8 láti ṣẹ̀dá àwọn dátà náà. A ṣe àtúnṣe ìwọ̀n agbára ìtànṣán àárín (MFI) ti 2-NBDG àti MT DR gẹ́gẹ́ bí àkọsílẹ̀, lẹ́yìn náà a lo ìdánwò t-pair fún ìwádìí ìṣirò láti ṣe àkíyèsí àwọn aláìsàn tí wọ́n bá ara wọn mu. Yọ gbogbo àwọn ènìyàn tí ìṣẹ̀lẹ̀ wọn kò ju ogójì lọ kúrò nínú ìwádìí náà; tẹ iye MFI ti 1 fún èyíkéyìí àwọn ìníyelórí odi kí o tó ṣe ìwádìí ìṣirò àti ìwòye dátà.
Láti lè fi ọgbọ́n ìfọwọ́sowọ́pọ̀ àgbékalẹ̀ ìlànà tí a gbé kalẹ̀ lókè yìí kún un, a lo àfikún gbogbo nípa igi ìdínà àwòrán (FAUST) (21) láti pín àwọn sẹ́ẹ̀lì sí àwùjọ láìfọwọ́sowọ́pọ̀ lẹ́yìn tí a bá ti yọ àwọn sẹ́ẹ̀lì òkú kúrò nínú FlowJo. A fi ọwọ́ ṣe àkóso àbájáde náà láti da àwọn ènìyàn tí ó dàbí pé a kò pín wọn sí ibi tí ó tọ́ pọ̀ (pípapọ̀ PD1+ pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì PD1-tumor) àti àwọn ènìyàn tí a pa mọ́. Àyẹ̀wò kọ̀ọ̀kan ní àròpín àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó ju 2% lọ, fún àpapọ̀ àwọn ènìyàn 11.
A lo centrifugation Ficoll gradient density centrifugation láti ya PBMC kúrò nínú àwọn ọjà ìyàsọ́tọ̀ leukocyte (STEMCELL Technologies). A ya àwọn sẹ́ẹ̀lì CD8 + T kúrò nínú PBMC nípa lílo CD8 MicroBeads (Miltenyi) a sì fẹ̀ sí i ní àárín pípé nípa lílo TransAct (Miltenyi) fún ọ̀sẹ̀ méjì gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè. A gbà àwọn sẹ́ẹ̀lì náà láàyè láti dúró fún ọjọ́ márùn-ún nínú àárín pípé tí ó ní IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), lẹ́yìn náà a tún fi TransAct ru wọ́n sókè. Ní ọjọ́ keje, gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè, a lo àwọn CD45 MicroBeads ènìyàn (Miltenyi) láti mú àwọn sẹ́ẹ̀lì pọ̀ sí i ní àwọn ìyípo mẹ́ta tí ó tẹ̀lé ara wọn. A pín àwọn sẹ́ẹ̀lì náà fún ìwádìí ìṣàn cytometry (gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ lókè), a sì pín àwọn sẹ́ẹ̀lì mílíọ̀nù kan sí méjì ní ìgbà mẹ́ta fún ìwádìí LC-MS/MS. A ṣe àgbékalẹ̀ àwọn àpẹẹrẹ náà nípasẹ̀ LC-MS/MS gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ ní ìsàlẹ̀. A ṣe ìṣirò iye metabolite tí ó sọnù pẹ̀lú nọ́mbà ion ti 1,000. A ṣe àyẹ̀wò kọ̀ọ̀kan gẹ́gẹ́ bí iye ion àpapọ̀ (TIC), a yí i padà lọ́nà logarithmically, a sì ṣe àtúnṣe rẹ̀ láìsí àtúnṣe láìsí àtúnṣe nínú MetaboAnalystR kí a tó ṣe àyẹ̀wò rẹ̀.
A yọ́ ìdádúró sẹ́ẹ̀lì kan ṣoṣo ti aláìsàn kọ̀ọ̀kan, a sì yọ́ wọn nípasẹ̀ àlẹ̀mọ́ 40 μm sí àárín gbùngbùn pípé (gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ lókè). Gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè, a lo àwọn ìpele mẹ́ta tí ó tẹ̀lé ara wọn ti yíyàn rere nípa lílo MicroBeads (Miltenyi) láti mú àwọn àyẹ̀wò fún àwọn sẹ́ẹ̀lì CD8+, CD4+ àti CD45- pọ̀ sí i (lórí yìnyín). Ní ​​kúkúrú, a tún fi àwọn sẹ́ẹ̀lì náà sínú ààbò ìdàgbàsókè sẹ́ẹ̀lì (gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ lókè) a sì kà wọ́n. A fi àwọn ilẹ̀ CD8 ènìyàn, àwọn ilẹ̀ CD4 ènìyàn tàbí àwọn ilẹ̀ CD45 ènìyàn (Miltenyi) sínú àwọn sẹ́ẹ̀lì náà ní 4°C fún ìṣẹ́jú 15, lẹ́yìn náà a fi ààbò ìdàgbàsókè sẹ́ẹ̀lì fọ̀ wọ́n. A fi àyẹ̀wò náà kọjá ọ̀wọ̀n LS (Miltenyi), a sì kó àwọn ìpín rere àti odi jọ. Láti dín àkókò náà kù àti láti mú kí ìgbésẹ̀ ìpadàbọ̀ sẹ́ẹ̀lì pọ̀ sí i, a lo ìpín CD8 fún ìpele kejì ti ìdàgbàsókè CD4+, a sì lo ìpín CD44 fún ìdàgbàsókè CD45 tí ó tẹ̀lé e. Pa ojutu náà mọ́ lórí yìnyín jálẹ̀ ilana ìyàsọ́tọ̀ náà.
Láti pèsè àwọn àpẹẹrẹ fún ìwádìí ìṣàyẹ̀wò, a fi omi iyọ̀ tútù wẹ̀ àwọn sẹ́ẹ̀lì náà lẹ́ẹ̀kan, a sì fi 1 milimita ti 80% methanol kún àpẹẹrẹ kọ̀ọ̀kan, lẹ́yìn náà a fi yòòn sí i, a sì fi sínú nitrogen omi. A fi àwọn àpẹẹrẹ náà sí àwọn ìpele didi-yòò mẹ́ta, a sì fi centrifuge sí i ní 14,000 rpm fún ìṣẹ́jú 15 ní 4°C. A fi omi tí ó wà nínú àwọn metabolites náà gbẹ títí tí yóò fi gbẹ. A tún tú àwọn metabolites náà sínú 50 μl ti 0.03% formic acid, a fi yòòn sí i láti dapọ̀ mọ́ ọn, lẹ́yìn náà a fi centrifuge sí i láti mú àwọn èérún kúrò.
Yọ awọn metabolites kuro bi a ti salaye loke. Gbe supernatant naa sinu igo chromatography omi ti o ga julọ fun iwadii metabolomics. Lo ilana itọju laileto lati tọju ayẹwo kọọkan pẹlu nọmba awọn sẹẹli kanna lati dena awọn ipa ipele. A ṣe ayẹwo didara ti awọn metabolites agbaye ti a tẹjade tẹlẹ lori AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). A ṣe itupalẹ Chromatographic ati isopọpọ agbegbe oke ni lilo sọfitiwia MultiQuant version 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
A lo iye ion ti 1000 lati ṣe iṣiro iye metabolite ti o sọnu, a si lo TIC ti ayẹwo kọọkan lati ṣe iṣiro agbegbe oke ti a ṣe deede ti metabolite ti a rii kọọkan lati ṣe atunṣe fun awọn iyipada ti a ṣe nipasẹ itupalẹ ohun elo lati sisẹ ayẹwo. Lẹhin ti a ti ṣe deedee TIC, a lo MetaboAnalystR(51) (paramita aiyipada) fun iyipada logarithmic ati wiwọn laini deede laifọwọyi. A lo PCA pẹlu package vegan R lati ṣe itupalẹ iwadii ti awọn iyatọ metabolome laarin awọn iru ayẹwo, ati lo itupalẹ apakan redundancy lati ṣe itupalẹ awọn alaisan. Lo ọna Ward lati kọ dendrogram maapu ooru lati ṣajọ ijinna Euclidean laarin awọn ayẹwo. A lo limma (52) lori ọpọlọpọ metabolite ti a ṣe deede lati ṣe idanimọ awọn metabolites ti o lọpọlọpọ jakejado gbogbo iru sẹẹli ati agbegbe kekere. Lati le jẹ ki alaye naa rọrun, a lo paramita apapọ ẹgbẹ lati ṣalaye awoṣe naa, ati ṣe akiyesi awọn iru sẹẹli ni agbegbe kekere bi ẹgbẹ kọọkan (n = awọn ẹgbẹ 6); Fún ìdánwò pàtàkì, a ṣe àwọn ìwọ̀n mẹ́ta tí a tún ṣe fún metabolite kọ̀ọ̀kan. Láti yẹra fún ìyípadà èké, a fi aláìsàn náà sí ìdènà nínú àwòrán limma. Láti lè ṣàyẹ̀wò ìyàtọ̀ nínú metabolites láàárín àwọn aláìsàn ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe àtúnṣe àpẹẹrẹ limma pẹ̀lú àwọn aláìsàn ní ọ̀nà tí a yàn. A ń ròyìn ìjẹ́pàtàkì ìyàtọ̀ tí a ti sọ tẹ́lẹ̀ láàárín irú sẹ́ẹ̀lì àti àyíká kékeré ti Padj <0.05 (àtúnṣe Benjamin-Hochberg).
Lẹ́yìn tí a ti lo ohun èlò ìyọkúrò sẹ́ẹ̀lì Miltenyi (tó ju 80% lọ), a ṣe ìtẹ̀léra transcriptome sẹ́ẹ̀lì kan ṣoṣo lórí gbogbo àwọn ascites tí ó ti dìdì àti àwọn àpẹẹrẹ tumor nípa lílo ìlànà ìgbékalẹ̀ gene 10x 5′. A ṣe àyẹ̀wò àwọn ọ̀ràn márùn-ún pẹ̀lú àwọn èèmọ́ àti ascites tí ó báramu, bó tilẹ̀ jẹ́ pé agbára ìṣiṣẹ́ díẹ̀ láti inú àpẹẹrẹ tumor kan dènà ìfàsẹ́yìn rẹ̀. Láti lè ṣe àṣeyọrí ọ̀pọ̀ àwọn aláìsàn, a da àwọn àpẹẹrẹ ti aláìsàn kọ̀ọ̀kan pọ̀ ní ọ̀nà ti olùdarí chromium 10x, a sì ṣe àyẹ̀wò àwọn ascites àti àwọn ibi tumor lọtọ̀ọ̀tọ̀. Lẹ́yìn ìtẹ̀léra [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genome Quebec; ní àròpín ìwọ̀n 73,488 àti 41,378 fún sẹ́ẹ̀lì kọ̀ọ̀kan fún èèmọ́ àti àsíìdì ní ìtẹ̀léra]], a lo CellSNP àti Vireo (53) (tí a gbé kalẹ̀ lórí CellSNP gẹ́gẹ́ bí SNP ènìyàn tí ó wọ́pọ̀ (VCF) tí GRCh38 pèsè ni a yàn fún ẹni tí ó jẹ́ olùfúnni. A lo SNPRelate láti mọ ẹni tí ó sún mọ́ jùlọ (IBS) ti ipò genotype aláìsàn (IBS), láìsí àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a kò yàn àti àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a mọ̀ sí duplexes àti àwọn olùfúnni tí ó báramu láàrín àwọn ascites àti àwọn àpẹẹrẹ èèmọ́ (54). Lórí ìpìlẹ̀ iṣẹ́ yìí, a pa àwọn ọ̀ràn mẹ́ta mọ́ pẹ̀lú àfihàn sẹ́ẹ̀lì púpọ̀ nínú èèmọ́ àti àsíìdì fún ìwádìí ìsàlẹ̀. Lẹ́yìn ṣíṣe ìgbésẹ̀ ìṣàlẹ̀ ibi-pupọ nínú àpò ìṣàyẹ̀wò (55) àti scran (56) BioConductor, èyí mú àwọn sẹ́ẹ̀lì 6975 jáde (2792 àti 4183 sẹ́ẹ̀lì láti inú èèmọ́ àti àsíìdì, ní ìtẹ̀léra) fún ìwádìí. A lo ìṣọ̀kan igraph (57) ti nẹ́ẹ̀tìwọ́ọ̀kì aládùúgbò tí a pín (SNN) tí ó sún mọ́ ara wọn tí a dá mọ̀ ní ìbámu pẹ̀lú ìjìnnà Jaccard sí àwọn sẹ́ẹ̀lì ìṣọ̀kan nípa ìfihàn. A fi ọwọ́ ṣe àpèjúwe àwọn ìṣọ̀kan náà sí àwọn irú sẹ́ẹ̀lì putative tí a gbé kalẹ̀ lórí ìfihàn jínì àmì, a sì fi t-SNE hàn wọ́n. A túmọ̀ àwọn sẹ́ẹ̀lì T Cytotoxic nípa ìfihàn CD8A àti GZMA, láìsí àwọn ìṣọ̀kan kéékèèké pẹ̀lú ìfihàn amuaradagba ribosomal tí ó kéré. A wọlé sí àwọn ìwádìí tí a tẹ̀ jáde ti Izar et al. (16), pẹ̀lú ìfimọ́ t-SNE wọn, le ṣàkóso ìfarahàn ìfarahàn láàárín àwọn àmì sẹ́ẹ̀lì ààbò àti ìfihàn NNMT.
A ya PBMC kuro ninu awọn ọja iyapa leukocyte (STEMCELL Technologies) nipasẹ centrifugation Ficoll gradient density centrifugation. A ya awọn sẹẹli CD3 + kuro ninu PBMC nipa lilo awọn beads CD3 (Miltenyi). Ni wiwa tabi laisi MNA, a mu awọn sẹẹli CD3+ ṣiṣẹ pẹlu CD3 ti a fi awo bo (5μg/ml), CD28 ti o ni soluble (3μg/ml) ati IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Ni ọjọ ikẹhin ti imugboroosi, a ṣe ayẹwo viability (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) ati progression (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) nipasẹ flow cytometry. Ṣe àyẹ̀wò iṣẹ́ olùṣe nípa fífún àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó ní PMA (20 ng/ml) àti ionomycin (1μg/ml) ní ìṣírí pẹ̀lú GolgiStop fún wákàtí mẹ́rin, kí o sì ṣe àyẹ̀wò CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) àti TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Fún àwọn sẹ́ẹ̀lì qPCR àti ChIP ní ìṣírí pẹ̀lú PMA (20 ng/ml) àti ionomycin (1μg/ml) fún wákàtí mẹ́rin. A gba àwọ̀ ELISA ṣáájú àti lẹ́yìn ìṣírí pẹ̀lú PMA (20 ng/ml) àti ionomycin (1 μg/ml) fún wákàtí mẹ́rin.
Tẹ̀lé ìlànà olùpèsè láti ya RNA sọ́tọ̀ nípa lílo RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Lo QIAshredder (QIAGEN) láti ṣe àfihàn àpẹẹrẹ náà. Lo RNA tí ó ní agbára gíga sí ohun èlò cDNA (Thermo Fisher Scientific) láti ṣe àkójọpọ̀ DNA (cDNA). Lo TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) láti ṣe ìwọ̀n ìfarahàn jínì (gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè) pẹ̀lú àwọn ìwádìí wọ̀nyí: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] àti Hs01010726_m1 (SLC22A2). A lo awọn ayẹwo naa lori eto PCR akoko-gidi StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) ninu awo ifaseyin MicroAmp fast optical 96-well (Applied Biosystems) pẹlu fiimu optical MicroAmp. Iye Ct eyikeyi ti o ba kọja 35 ni a ka si pe o wa loke opin wiwa ati pe a samisi rẹ bi eyiti a ko le rii.
Ṣe ChIP gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀ (58). Ní ​​kúkúrú, a fi formaldehyde (ìwọ̀n ìkẹyìn 1.42%) tọ́jú àwọn sẹ́ẹ̀lì náà, a sì fi sínú ihò ní iwọ̀n otútù yàrá fún ìṣẹ́jú 10. Lo àfikún ìwúwo (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl àti 0.1% NP-40) lórí yìnyín fún ìṣẹ́jú 10, lẹ́yìn náà a tún fi sínú àpò ìdènà ìdènà gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ (58). Lẹ́yìn náà, a fi àwọn ìyípo wọ̀nyí sí i pẹ̀lú àwọn ìyípo wọ̀nyí: ìyípo 10 (ìyípo 20 1-second pulses) àti àkókò àìdúró ti ìṣẹ́jú 40. Incubate ChIP-grade immunoglobulin G (Ẹ̀rọ Ìdènà Ẹ̀rọ; 1μl), histone H3 (Ẹ̀rọ Ìdènà Ẹ̀rọ; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) àti SP1 (Ẹ̀rọ Ìdènà Ẹ̀rọ; 3μl) pẹ̀lú àyẹ̀wò náà ní 4°CC mì ní alẹ́. Fi àwọn ìlẹ̀kẹ̀ amuaradagba A (Thermo Fisher Scientific) sínú àyẹ̀wò náà ní 4°C pẹ̀lú fífì díẹ̀díẹ̀ fún wákàtí kan, lẹ́yìn náà lo àwọn ìlẹ̀kẹ̀ chelex (Bio-Rad) láti mú kí DNA náà sunwọ̀n síi, kí o sì lo proteinase K (Thermo Fisher) fún jíjẹ amuaradagba. PCR ló ṣàwárí olùgbékalẹ̀ TNFα: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ní ìlòdì sí èyí, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (ọjà 207-bp). Image Lab (Bio-Rad) ló ṣe àwọn àwòrán náà, wọ́n sì fi software ImageJ ṣe ìwọ̀n wọn.
A gba ohun tí ó ń yọ àwọ̀ ara sẹ́ẹ̀lì gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ lókè yìí. A ṣe ìpinnu náà gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè ti ohun èlò TNFα ELISA ènìyàn (Invitrogen), ohun èlò ELISA ènìyàn IL-2 (Invitrogen) àti ohun èlò ELISA ènìyàn (Abcam). Gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè, a fi omi pò ohun èlò tí ó ń yọ àwọ̀ ara náà ní ìwọ̀n 1:100 láti ṣàwárí TNFα àti IL-2, àti 1:3 láti ṣàwárí IFN-γ. Lo EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) láti wọn ìfàmọ́ra ní 450 nm.
A ya PBMC kuro ninu awọn ọja iyapa leukocyte (STEMCELL Technologies) nipasẹ centrifugation Ficoll gradient density centrifugation. A ya awọn sẹẹli CD3 + kuro ninu PBMC nipa lilo awọn beads CD3 (Miltenyi). Ni wiwa tabi laisi MNA, a mu awọn sẹẹli CD3+ ṣiṣẹ pẹlu CD3 ti a fi awo bo (5μg/ml), CD28 ti o ni iyọ (3μg/ml) ati IL-2 (300 U/ml; Proleukin) fun ọjọ mẹta. Lẹhin ọjọ mẹta, a gba awọn sẹẹli naa jọ a si fi 0.9% saline fọ wọn, a si fi pellet naa di didi. A ṣe iye awọn sẹẹli nipasẹ cytometry flow (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R iṣeto) nipa lilo eBeads 123count.
Àwọn metabolites tí a yọ jáde gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ lókè yìí. A tún un ṣe àtúnṣe sí ìpele sẹ́ẹ̀lì 4000/μl. Ṣe àyẹ̀wò àpẹẹrẹ náà nípa chromatography ìpele tí a yí padà (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) àti CORTECS T3 column (2.1×150 mm, ìwọ̀n particle 1.6-μm, ìwọ̀n pore 120-Å; #186008500, Waters). Polar mass spectrometer (6470, Agilent), nínú èyí tí electrospray ionization ń ṣiṣẹ́ ní ipò rere. Mobile phase A jẹ́ 0.1% formic acid (nínú H2O), mobile phase B jẹ́ 90% acetonitrile, 0.1% formic acid. Ìwọ̀n LC jẹ́ ìṣẹ́jú 0 sí 2 fún 100% A, ìṣẹ́jú 2 sí 7.1 fún 99% B, àti ìṣẹ́jú 7.1 sí 8 fún 99% B. Lẹ́yìn náà, tún ṣe àtúnṣe ọ̀wọ̀n náà pẹ̀lú ìpele A tí ń gbé kiri ní ìwọ̀n ìṣàn ti 0.6 ml/min fún ìṣẹ́jú 3. . Ìwọ̀n ìṣàn náà jẹ́ 0.4ml/min, a sì gbóná yàrá ọ̀wọ̀n náà sí 50°C. Lo ìwọ̀n kẹ́míkà mímọ́ ti MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) láti fi àkókò ìpamọ́ (RT) àti ìyípadà múlẹ̀ (RT = ìṣẹ́jú 0.882, ìyípadà 1 = 137→94.1, ìyípadà 2 = 137→92, Ìyípadà 3 = 137→78). Nígbà tí gbogbo àwọn ìyípadà mẹ́tẹ̀ẹ̀ta bá ṣẹlẹ̀ ní àkókò ìpamọ́ tó tọ́, ìyípadà 1 ni a lò fún ìwọ̀n láti rí i dájú pé ó ṣe pàtó. A ṣe agbekalẹ ìtẹ̀síwájú MNA (Ilé-iṣẹ́ Kemikali Toronto) nípa lílo ìfọ́pọ̀ mẹ́fà ti omi ìṣúra (1 mg/ml) láti gba àwọn ìwọ̀n 0.1, 1.0, 10 àti 100 ng/ml àti 1.0 àti 10μg/ml lẹ́sẹẹsẹ omi. Ààlà ìwádìí náà jẹ́ 1 ng/ml, ìdáhùn ìlà sì wà láàrín 10 ng/ml àti 10 μg/ml. A lo abẹ́rẹ́ microliters méjì ti àpẹẹrẹ àti ìwọ̀n kọ̀ọ̀kan fún ìwádìí LC/MS, a sì ń ṣe àyẹ̀wò ìṣàkóṣo dídára àdàpọ̀ ní gbogbo abẹ́rẹ́ mẹ́jọ láti rí i dájú pé ìdúróṣinṣin ti pẹpẹ ìwádìí náà dúró ṣinṣin. Àwọn ìdáhùn MNA ti gbogbo àwọn àyẹ̀wò sẹ́ẹ̀lì tí a tọ́jú MNA wà láàrín ìwọ̀n ìlà ti ìwádìí náà. A ṣe ìwádìí dátà nípa lílo software ìṣàyẹ̀wò MassHunter (v9.0, Agilent).
A mú ìṣètò ìran kejì αFR-CAR láti inú Song àti àwọn ẹlòmíràn (59). Ní ​​kúkúrú, ìṣètò náà ní àwọn àkóónú wọ̀nyí: ìṣètò aṣáájú CD8a, ìpín oníyípadà onípele kan pàtó ti ènìyàn αFR, agbègbè ìfàmọ́ CD8a àti transmembrane, agbègbè intracellular CD27 àti agbègbè intracellular CD3z. GenScript ló ṣe ìṣètò ìṣètò CAR pípé, lẹ́yìn náà a fi ẹ̀rọ ìṣàfihàn lentiviral ìran kejì sí òkè kasẹti ìṣàfihàn GFP tí a lò láti ṣe àyẹ̀wò bí ìyípadà ṣe ń ṣiṣẹ́.
A ń ṣe Lentivirus nípa lílo transfection ti àwọn sẹ́ẹ̀lì HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); tí a gbìn sínú àwopọ̀ Eagle tí a ṣe àtúnṣe sí Dulbecco tí ó ní 10% serum ẹran ọsìn ọmọ inú oyun (FBS) àti 1% PenStrep, a sì lo CAR-GFP vector àti plasmids tí a fi package (psPAX2 àti pMD2.G, Addene) lo lipofection amine (Sigma-Aldrich). A gba supernatant tí ó ní fáírọ́ọ̀sì náà ní wákàtí 48 àti 72 lẹ́yìn transfection, a yọ́, a sì fi ultracentrifugation dì í mọ́ra. Tọ́jú supernatant tí ó ní fáírọ́ọ̀sì náà ní -80°C títí di ìgbà transduction.
A ya PBMC kuro ninu awọn ọja iyapa leukocyte ti o ni ilera fun awọn olufunni (STEMCELL Technologies) nipasẹ centrifugation Ficoll gradient density centrifugation. Lo awọn microbeads CD8 ti o dara (Miltenyi) lati ya awọn sẹẹli CD8+ kuro ninu PBMC. Mu awọn sẹẹli T ṣiṣẹ pẹlu TransAct (Miltenyi) ati ninu alabọde TexMACS [Miltenyi; ti a fi 3% serum eniyan ti ko ṣiṣẹ ooru, 1% PenStrep ati IL-2 (300 U/ml) kun]. Wakati mẹrinlelogun lẹhin iwuri, a fa awọn sẹẹli T sinu lentivirus (10 μl ti o ni agbara ọlọjẹ ti o ṣopọ fun awọn sẹẹli 106). Ọjọ 1 si 3 lẹhin gbigbe lori Cytek Aurora (lori FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), ṣe ayẹwo ikosile GFP ti awọn sẹẹli lati fihan ṣiṣe transduction ti o kere ju 30%.
A gbin awọn sẹẹli CAR-T fun wakati 24 ninu Immunocult (STEMCELL Technologies; ti a fi 1% PenStrep kun) labẹ awọn ipo wọnyi: ti ko tọju, ti a fi adenosine 250 μM tabi 10 mM MNA tọju. Lẹhin itọju ṣaaju, a fi PBS fọ awọn sẹẹli CAR-T a si dapọ mọ awọn sẹẹli SK-OV-3 20,000 [ATCC; ninu alabọde McCoy 5A (Sigma-Aldrich) ti a fi 10% FBS ati 1% PenStrep kun ni 10: A mu ipin ti o n ṣe si afojusun ti 1 pọ si ni mẹta-mẹta ninu alabọde Immunocult afikun. Awọn sẹẹli SK-OV-3 ati awọn sẹẹli SK-OV-3 ti a fi saponin digitalis lysed (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) ti a fi lysed gẹgẹbi awọn iṣakoso odi ati rere, lẹsẹsẹ. Lẹ́yìn wákàtí mẹ́rìnlélógún tí a ti ń tọ́jú ara wọn, a kó ohun tí ó wà lára ​​wọn jọ, a sì wọn lactate dehydrogenase (LDH) gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). A fi omi pò ohun tí ó wà nínú LDH 1:50 nínú LDH buffer. A fi ìwọ̀n ìpín ogorun ìpànìyàn náà wọ̀n nípa lílo àwọn fọ́múlá wọ̀nyí: ìpín ogorun ìpànìyàn = ìpín ogorun ìtúnṣe / ìwọ̀n ìpànìyàn tó pọ̀jù x 100%, níbi tí ìpín ogorun ìtúnṣe = àwọn sẹ́ẹ̀lì co-culture-T nìkan, àti ìwọ̀n ìpànìyàn tó pọ̀jù = ìṣàkóso rere-odi.
Gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ nínú ìwé tàbí àwọn ohun èlò àti ọ̀nà, lo GraphPad Prism 8, Microsoft Excel tàbí R v3.6.0 fún ìwádìí ìṣirò. Tí a bá gba ọ̀pọ̀lọpọ̀ àpẹẹrẹ láti ọ̀dọ̀ aláìsàn kan náà (bíi ascites àti tumor), a máa lo ìdánwò t tí a so pọ̀ tàbí kí a fi aláìsàn náà kún un gẹ́gẹ́ bí ipa àìròtẹ́lẹ̀ nínú àwòṣe linear tàbí generalized bí ó ṣe yẹ. Fún ìwádìí metabolomics, a máa ṣe ìdánwò pàtàkì ní ìpele mẹ́ta.
Fún àwọn ohun èlò afikún fún àpilẹ̀kọ yìí, jọ̀wọ́ wo http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Àpilẹ̀kọ yìí jẹ́ ìwé tí a pín síta lábẹ́ àwọn òfin Creative Commons Attribution-Non-Commerce License, èyí tí ó fún lílo, pínpín àti àtúnṣe ní ọ̀nà èyíkéyìí, níwọ̀n ìgbà tí lílo ìkẹyìn kò bá jẹ́ fún èrè ìṣòwò àti pé àbá náà ni pé iṣẹ́ àtilẹ̀wá náà tọ́. Ìtọ́kasí.
Àkíyèsí: A kàn ń béèrè lọ́wọ́ rẹ láti fún ọ ní àdírẹ́sì ìmeeli rẹ kí ẹni tí o bá dámọ̀ràn sí ojú ìwé náà lè mọ̀ pé o fẹ́ kí wọ́n rí ìmeeli náà àti pé kì í ṣe àwúrúju. A kò ní gba àdírẹ́sì ìmeeli kankan.
A lo ibeere yii lati danwo boya alejo ni o ati lati dena ifisilẹ spam laifọwọyi.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H.. Nelson), Ralph J. De Bell Jardini Grar Jones (R.ph Nelson) (R.ph. Nelson) Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA ń ṣe alabapin si idinku ajesara awọn sẹẹli T ati pe o duro fun ibi-afẹde ajẹsara ti o ṣeeṣe fun itọju akàn eniyan.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H.. Nelson), Ralph J. De Bell Jardini Grar Jones (R.ph Nelson) (R.ph. Nelson) Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA ń ṣe alabapin si idinku ajesara awọn sẹẹli T ati pe o duro fun ibi-afẹde ajẹsara ti o ṣeeṣe fun itọju akàn eniyan.
©2021 Ẹgbẹ Amẹrika fun Ilọsiwaju ti Imọ. gbogbo awọn ẹtọ wa ni ipamọ. AAAS jẹ alabaṣepọ ti HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ati COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.