Ẹ ṣeun fún ṣíbẹ̀wò sí Nature.com. Ẹ̀yà ẹ̀rọ ìṣàwárí tí ẹ ń lò ní àtìlẹ́yìn díẹ̀ fún CSS. Fún ìrírí tí ó dára jùlọ, a gbà yín nímọ̀ràn pé kí ẹ lo ẹ̀rọ ìṣàwárí tí a ti mú gbóná (tàbí kí ẹ pa ipò ìbáramu nínú Internet Explorer). Ní ​​àkókò yìí, láti rí i dájú pé a ń tẹ̀síwájú láti ṣe àtìlẹ́yìn, a ó máa fi ojú-ọ̀nà náà hàn láìsí àwọn àṣà àti JavaScript.
Láìdàbí àwọn ẹ̀yà ara ẹlẹ́gbẹ́, a gbàgbọ́ pé kòkòrò kò ní àwọn homonu steroid ìbálòpọ̀ tí ó jẹ́ ti ọkùnrin. Nínú Anopheles gambiae, steroid ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) dàbí ẹni pé ó ti yípadà láti ṣàkóso ìdàgbàsókè ẹyin nígbà tí àwọn obìnrin bá ṣe é2 àti láti fa àkókò ìfaradà ìbáṣepọ̀ nígbà tí àwọn ọkùnrin bá gbé ìbálòpọ̀ lọ. Níwọ́n ìgbà tí ìdàgbàsókè ẹyin àti ìbáṣepọ̀ jẹ́ àwọn ànímọ́ ìbímọ pàtàkì, òye bí àwọn efon Anopheles obìnrin ṣe ń so àwọn àmì homonu wọ̀nyí pọ̀ lè mú kí àwọn ètò ìṣàkóso iba tuntun rọrùn. Níbí, a fihàn pé àwọn iṣẹ́ ìbímọ wọ̀nyí ni a ń ṣe ìṣàkóso nípasẹ̀ àwọn steroid ìbálòpọ̀ tí ó yàtọ̀ síra nípasẹ̀ nẹ́tíwọ́ọ̀kì dídíjú ti àwọn enzymes ecdysteroid-activating/inactivating. A ṣàwárí ecdysone tí a ti ṣe oxidized fún ọkùnrin kan, 3-dehydro-20E (3D20E), tí ó ń dáàbò bo ìyá nípa pípa ìgbàwọlé ìbálòpọ̀ obìnrin lẹ́yìn ìfijiṣẹ́ ìbálòpọ̀ àti ìfijiṣẹ́ nípasẹ̀ dephosphorylation. Ní pàtàkì, ìfijiṣẹ́ 3D20E tún fa ìfarahàn àwọn jiini ìbímọ tí ó ń ṣe àtìlẹ́yìn ìdàgbàsókè ẹyin nígbà àkóràn Plasmodium, tí ó ń rí i dájú pé àwọn obìnrin tí ó ní àkóràn ní ìlera. 20E tí a ti inú obìnrin kò fa ìbálòpọ̀. ìdáhùn, ṣùgbọ́n ó ń jẹ́ kí àwọn ènìyàn tí wọ́n bá fẹ́ ara wọn pọ̀ lè lẹ̀ ẹyin lẹ́yìn tí a bá ti dí àwọn kinases tí ń dènà 20E lọ́wọ́. Ìdámọ̀ homonu steroid kòkòrò yìí tí ó jẹ́ ti ọkùnrin àti ipa rẹ̀ nínú ṣíṣàkóso gbígbà ìbálòpọ̀ obìnrin, ìbímọ àti ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú Plasmodium fihàn pé ó ṣeé ṣe láti dín àṣeyọrí ìbímọ àwọn efon tí ń gbé ibà jáde kù.
Àwọn ọ̀ràn ibà àti ikú tún ń pọ̀ sí i lẹ́ẹ̀kan sí i nítorí àìlèṣe ìpakúpa kòkòrò ní àwọn efon Anopheles, tí í ṣe ẹ̀yà kan ṣoṣo tí ó ń fa àwọn kòkòrò ibà ènìyàn. Ìbálòpọ̀ àwọn efon wọ̀nyí jẹ́ ibi tí ó fani mọ́ra fún àwọn ìtọ́jú ìdènà ibà tuntun nítorí pé àwọn obìnrin kan ṣoṣo ló ń bá ara wọn lòpọ̀; jíjẹ́ kí ìbálòpọ̀ kan ṣoṣo yìí jẹ́ aláìlera yóò ní agbára ńlá láti dín iye àwọn efon kù nínú pápá.
Àwọn obìnrin máa ń di aláìlera nípa ìbálòpọ̀ lẹ́yìn tí wọ́n bá ti gba àwọn homonu steroid tó ní ìwọ̀n gíga láti ọ̀dọ̀ àwọn ọkùnrin. Àwọn ìwádìí ti fihàn pé ohun tó ń fa ìṣòro nínú ìbáṣepọ̀ síwájú ni 20-hydroxyecdysone (20E), homonu steroid kan tí a mọ̀ sí olùṣàkóso ìyípo molting ní ìpele ìdin. Agbára àwọn ọkùnrin láti ṣe àgbékalẹ̀ àti láti gbé 20E ti yípadà ní pàtó nínú àwọn ẹ̀yà Anopheles tí ó jẹ́ ara ẹ̀yà Cellia7, èyí tí a pín káàkiri ní Áfíríkà tí ó sì ní àwọn ohun tí ó léwu jùlọ nínú ibà, títí kan Anopheles gambiae. Èyí ṣe pàtàkì ní pàtàkì nítorí pé nínú àwọn ẹ̀yà wọ̀nyí àwọn obìnrin tún ń ṣe 20E lẹ́yìn oúnjẹ ẹ̀jẹ̀ kọ̀ọ̀kan, àti 20E ń darí ìyípo oogenesis (wo àfikún 8). Síbẹ̀síbẹ̀, a kò mọ̀ púpọ̀ nípa ọ̀nà tí àwọn obìnrin ń gbà so àwọn àmì pọ̀ láti orísun méjì ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ ti ecdysone (ìgbésẹ̀ ọkùnrin àti ìfàjẹ̀sí ẹ̀jẹ̀) láìsí ìpalára agbára wọn láti bá ara wọn lòpọ̀. Ní tòótọ́, tí 20E tí àwọn obìnrin ń ṣe bá fa àìnífaradà ìbálòpọ̀, èyí yóò yọrí sí àìlóyún nínú àwọn ènìyàn tí wọ́n ń fún ní oúnjẹ wúńdíá, ìwà tí ó wọ́pọ̀ nínú àwọn efon wọ̀nyí5.
Àlàyé tó ṣeé ṣe ni pé àwọn ọkùnrin A. gambiae máa ń gbé ecdysone tó yàtọ̀ sí ti ọkùnrin kan, èyí tó máa ń mú kí ìfàmọ́ra kan wáyé nínú ìbímọ obìnrin, èyí tó máa ń yọrí sí àìdúróṣinṣin nínú ìbáṣepọ̀. Síbẹ̀síbẹ̀, bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn ẹranko onípele ní ọ̀pọ̀lọpọ̀ hómónù sítródíọ̀mù, bíi estrogen àti androgen (tí a ṣe àtúnyẹ̀wò rẹ̀ nínú àfikún 9), gẹ́gẹ́ bí a ṣe mọ̀, a kò tíì rí àwọn hómónù onípele androgenic nínú àwọn kòkòrò.
A pinnu láti pinnu àpapọ̀ àwọn homonu sitẹriodu ninu ẹṣẹ akọ (MAG) ti A. gambiae ti o dagba nipa ibalopọ lati wa awọn sitẹriọdu ti o le yipada. Nipa lilo chromatography omi ti o ga ti a so pọ mọ pẹlu tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) dipo ọna ti ko ṣe pataki ti a lo tẹlẹ, a ṣe awari ecdysone (E) ati 20E ninu àsopọ yii, ti o jẹrisi abajade iṣaaju. Sibẹsibẹ, ayẹwo naa ni awọn sitẹriọdu phosphorylated oxidized ṣe olori, ni ibamu pẹlu agbekalẹ 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Aworan 1). Awọn fọọmu miiran pẹlu 3-dehydro-20E (3D20E) ati 20E-22-phosphate (20E22P). Iwọn ifihan agbara HPLC-MS/MS ti 3D20E22P jẹ awọn aṣẹ titobi meji ti o ga ju fọọmu dephosphorylated rẹ lọ, 3D20E, ati awọn aṣẹ iwọn mẹta ti o ga ju ti E ati 20E lọ (Aworan 1). Botilẹjẹpe ni awọn apa miiran ti ara àti ìsàlẹ̀ ibimọ (LRT; Ìfihàn Ìtẹ̀síwájú Àwòrán 1a). A tún ṣe àyẹ̀wò àwọn ecdysteroids nínú àwọn ọkùnrin àti obìnrin tí wọ́n ṣẹ̀ṣẹ̀ ti pa (tí kò ju ọjọ́ kan lọ) a sì rí 3D20E àti 3D20E22P nínú MAG nìkan; E, 20E àti 20E22P wà nínú àwọn ọkùnrin àti obìnrin méjèèjì (Ìfihàn Ìtẹ̀síwájú Àwòrán 1b). Àwọn ìwádìí wọ̀nyí fihàn pé àwọn ọkùnrin àgbàlagbà A. gambiae máa ń mú àwọn homonu tó ń yí padà nínú MAG wọn jáde tí àwọn obìnrin kò ṣe.
A gé MAG àti abo LRT (pẹ̀lú atria, seminal vesicles, àti parovarium) kúrò lára ​​àwọn wúńdíá ọmọ ọjọ́ mẹ́rin (ọjọ́ mẹ́rin) ọkùnrin àti obìnrin wúńdíá àti àwọn tí wọ́n ti bá ara wọn (0.5, 3, àti 12 hpm). A ṣe àyẹ̀wò Ecdysone nínú àwọn àsopọ̀ wọ̀nyí nípasẹ̀ HPLC-MS/MS (àròpọ̀ ± sem; ìdánwò t-test tí kò ní ìsopọ̀, ẹ̀gbẹ́ méjì, ìwọ̀n ìwádìí èké (FDR) tí a túnṣe; NS, kò ṣe pàtàkì; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: Wákàtí 3 sí Wákàtí 0.5, P = 0.035; Wákàtí 12 sí Wákàtí 3, P = 0.0015; Wákàtí 12 sí Wákàtí 0.5, P = 0.030. 3D20E22P: Wákàtí 3 sí Wákàtí 0.5, P = 0.25; Wákàtí 12 sí Wákàtí 3, P = 0.0032; Wákàtí 12 sí Wákàtí 0.5, P = 0.015). Dátà náà wá láti inú àwọn àtúnṣe ẹ̀dá mẹ́ta. A ṣírò agbègbè òkè fún gbogbo ecdysone tí ó wù ú, a sì ṣe àtúnṣe rẹ̀ nípa iye àwọn efon. A fi àwọ̀ ecdysone ṣe àfihàn rẹ̀ gẹ́gẹ́ bí àtẹ̀lé yìí: E, ewé; 20E, osàn; 20E22P, elése àlùkò; 3D20E, búlúù; 3D20E22P, pupa. Àwòrán inú rẹ̀ mú kí ìwọ̀n lórí y-axis pọ̀ sí i láti fi àwọn ìpele ecdysone tí ó lọ sílẹ̀ hàn.
Láti ṣe ìwádìí bóyá a gbé 3D20E22P àti 3D20E lásìkò ìbáṣepọ̀, a gé àwọn LRT obìnrin ní oríṣiríṣi àkókò lẹ́yìn ìbáṣepọ̀. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a kò rí ecdysone nínú àwọn wundia, a rí iye 3D20E22P tó pọ̀ nínú LRT lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ lẹ́yìn ìbáṣepọ̀ (wákàtí 0.5 lẹ́yìn ìbáṣepọ̀, hpm), èyí tó ń dínkù nígbà tó bá yá, nígbà tí ipele 3D20E pọ̀ sí i gidigidi (Àwòrán 1). Nípa lílo 3D20E tí a fi kẹ́míkà ṣe gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n, a pinnu pé ipele homonu steroid yìí nínú ìbáṣepọ̀ LRTs jẹ́ ó kéré tán ìlọ́po 100 ju 20E lọ (Àtẹ Ìdáhùn Tí A Gbé Sílẹ̀ 1). Nítorí náà, 3D20E22P ni ecdysone akọ pàtàkì tí a gbé sí LRT obìnrin nígbà ìbáṣepọ̀, àti pé ìrísí rẹ̀ tí a ti yọ phosphorylated, 3D20E, di púpọ̀ ní kété lẹ́yìn ìbáṣepọ̀. Èyí dámọ̀ràn ipa pàtàkì fún ecdysone ìkẹyìn nínú ìmọ̀ nípa ẹ̀dá obìnrin lẹ́yìn ìbáṣepọ̀.
Lẹ́yìn tí a ṣe àgbékalẹ̀ ìṣètò RNA tuntun (RNA-seq) (Àwòrán 2a), nípa lílo ọ̀nà ìṣiṣẹ́ bioinformatics tí a ṣe àdáni, a wá ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), àti ecdysone tí ó ń ṣàkójọ 20E-modified phosphatase gene.EPP) ni a ń fihàn nínú àwọn àsopọ ìbímọ. A ṣàwárí jínì EPP kan tí ó lè ṣe àfihàn àti jínì ECK méjì tí ó ṣeéṣe (EcK1 àti Eck2), ṣùgbọ́n a kò lè rí jínì EO tí ó dára. Lóòótọ́, a fi àwọn jínì EPP kọ̀ọ̀kan hàn ní àwọn ìpele gíga (ìpín 98.9th) nínú àwọn MAG Gambian ṣùgbọ́n kìí ṣe nínú àwọn LRT obìnrin (Àwòrán 2b), ní ìlòdì sí àwọn ìfojúsùn wa láti ìgbà tí dephosphorylation ti 3D20E22P ti ṣẹlẹ̀ nínú àsopọ obìnrin yìí. Nítorí náà, a gbàgbọ́ pé a lè gbé EPP ọkùnrin nígbà ìbáṣepọ̀. Ní tòótọ́, a lo àmì isotope tí ó dúró ṣinṣin nínú vivo láti bo prótínì obìnrin náà mọ́ lẹ́yìn ìbáṣepọ̀, enzyme tí MS dámọ̀ nínú atrium obìnrin (Àwòrán 2c àti Àtẹ Àfikún 1). A tún fi ìdí rẹ̀ múlẹ̀ pé EPP wà nínú MAG àti pé LRT obìnrin tí wọ́n ti bá ara wọn (ṣùgbọ́n tí kì í ṣe wúńdíá) ni a lò láti fi àwọn èròjà ara pàtó kan hàn (Àwòrán 2d).
a, Opopona bioinformatics ti a ṣe ni aṣa lati wa awọn àsopọ ibisi ti abo kọọkan fun awọn jiini ti o n ṣe koodu Ecks, EOs, ati EPPs. Awọn nọmba ti o wa lẹgbẹẹ awọn ọfà tọka nọmba awọn oludije ọkunrin ati obinrin ni igbesẹ kọọkan. Itupalẹ yii ṣe idanimọ jiini EPP kan (EPP) ati jiini Eck kan (EcK1) ti a fihan ninu awọn ọkunrin, ati jiini Eck kan (EcK2) ti a fihan ninu awọn mejeeji ṣugbọn ko funni ni gene EO oludije.b, Heatmap ti o nfi ikosile jiini oludije we ninu wundia (V) ati ibaramu (M) Awọn tissues Anopheles gambiae ati Anopheles albicans.Spca, idapọ; MAGs, awọn keekeke ẹya ẹrọ ninu awọn ọkunrin; Àwọn ẹ̀yà ara mìíràn, títí bí ọmú, ìyẹ́ apá, ẹsẹ̀, ara ọ̀rá, àti àwọn ẹ̀yà ara inú méjèèjì, àti àwọn ẹyin nínú àwọn obìnrin. EcK2 hàn gbangba nínú MAG àti atria ti Gambia, nígbàtí EPP wà nínú MAG.c nìkan, ìwádìí Proteomic ti ìyípadà ẹgbẹ́ ìfọ́mọ ọkùnrin sí atria obìnrin ní 3, 12 àti 24 hpm, tí ó fi àwọn protein 67 tí ó pọ̀ jùlọ hàn. A tọ́ àwọn obìnrin dàgbà lórí oúnjẹ tí ó ní 15N láti fi àmì sí (àti láti fi bo gbogbo protein). A fi àwọn akọ tí kò ní àmì sí i pọ̀ mọ́ àwọn abo tí a fi àmì sí i, a sì gé àwọn LRT obìnrin ní 3, 12 àti 24 hpm fún ìwádìí proteomic (wo Àfikún Táblì 1 fún àkójọ pípé ti àwọn protein ìfọ́mọ). A rí inset, EPP, Eck1 àti Eck2 nínú MAG ti àwọn akọ wundia nípa ìwádìí proteomic ti àwọn àsopọ wọ̀nyí.d, a rí EPP nípasẹ̀ western blot nínú MAG àti LRT ti àwọn abo tí wọ́n ti bá ara wọn ṣe pọ̀, ṣùgbọ́n kìí ṣe nínú àwọn abo wundia tàbí àwọn akọ tàbí gbogbo ara obìnrin. A ṣe ìwádìí lórí àwọn awọ ara ní àkókò kan náà pẹ̀lú àwọn anti-actin (ìṣàkóso ẹrù) àti àwọn antibodies anti-EPP. Gbogbo àwọn ọkùnrin jẹ́ wúńdíá. Wo Àfikún Àwòrán 1 fún ìwádìí orísun gel. A ṣe àwọn ìdènà Western nígbà méjì pẹ̀lú àwọn àbájáde tó jọra.
A fi idi iṣẹ ṣiṣe ecdysteroid phosphophosphatase ti EPP mulẹ lẹhin incubation nipasẹ HPLC-MS/MS pẹlu 3D20E22P ti a ya sọtọ lati inu MAG (Fended Data Fig. 2a). Pẹlupẹlu, nigbati a pa EPP mọ nipasẹ kikọlu RNA ti o ni ipa lori, a rii idinku to lagbara ninu iṣẹ ṣiṣe phosphatase ninu awọn àsopọ ibisi ti awọn ọkunrin wọnyi (Fig. 3a), ati awọn obinrin ti o ba awọn ọkunrin ti o ni ipa lori EPP ṣe afihan pataki A ipin ti o kere si ti dephosphorylated 3D20E (Fig. 3b) laibikita ipalọlọ jiini apakan (Ftended Data Fig. 2b,c). Ni idakeji, a ko rii awọn iyipada pataki ninu ipin 20E22P/20E ninu awọn efon kanna, eyiti o le daba pe enzyme jẹ pato fun 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Iṣẹ́ phosphatase tó dínkù nínú MAG tí ìdákẹ́jẹ́ EPP ń fà nípa lílo àwọn ìṣàkóso EPP RNA oní-okùn méjì (dsEPP) tàbí GFP RNA oní-okùn méjì (dsGFP). A lo ogún àwọn adágún MAG nínú àtúnṣe kọ̀ọ̀kan (P = 0.0046, ìdákẹ́jẹ́ t-test, oní-okùn méjì), tí àwọn àmì ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ dúró fún.b, Àwọn obìnrin tí wọ́n bá àwọn ọkùnrin tí wọ́n bá EPP dákẹ́ ní ìpín tí ó kéré síi ti dephosphorylated 3D20E ní 3 hpm (P = 0.0043, ìdákẹ́jẹ́ t-test tí kò ní àdàpọ̀, oní-okùn méjì), nígbà tí àwọn ìpele 20E kò ní ipa lórí (P = 0.063, tí kò ní àdàpọ̀). ìdánwò t, ẹ̀gbẹ́ méjì). A gbé àwọn ìwádìí kalẹ̀ gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n ± sem láti inú àwọn adágún mẹ́ta ti obìnrin 13, 16 àti 19 kọ̀ọ̀kan.c, Àwọn obìnrin tí wọ́n bá àwọn ọkùnrin tí EPP dákẹ́ ní ìwọ̀n ìbáṣepọ̀ tí ó ga jùlọ (P = 0.0002, ìdánwò Fisher gangan, ẹ̀gbẹ́ méjì). A kọ́kọ́ fipá mú àwọn obìnrin láti bá ara wọn ṣe ìbáṣepọ̀ láti rí i dájú pé wọ́n ní ipò ìbáṣepọ̀; Ní ọjọ́ méjì lẹ́yìn náà, wọ́n kan àwọn ọkùnrin mìíràn tí wọ́n ní sperm transgenic láti ṣe àyẹ̀wò ìwọ̀n ìbáṣepọ̀ nípa ṣíṣe àwárí PCR oníwọ̀n ti transgene.d, àwọn obìnrin tí wọ́n jẹ ẹ̀jẹ̀ tí wọ́n bá àwọn ọkùnrin tí EPP pa lẹ́nu mọ́ ti dín ìbímọ kù ní pàtàkì (P < 0.0001; ìdánwò Mann-Whitney, ẹ̀gbẹ́ méjì) àti iye ẹyin tí ó dínkù díẹ̀ (P = 0.088, ìdánwò Mann-Whitney, ẹ̀gbẹ́ méjì), nígbà tí ìwọ̀n ìbímọ kò ní ipa lórí (P = 0.94, ìdánwò Fisher gangan, ẹ̀gbẹ́ méjì). Nínú gbogbo àwọn páìnì, n dúró fún iye àwọn àyẹ̀wò efon tí kò ní ìlera nípa ti ẹ̀dá.NS, kì í ṣe pàtàkì.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Lẹ́yìn náà, a ṣe àyẹ̀wò bóyá ecdysone dephosphorylation ṣe pàtàkì fún fífún àwọn obìnrin ní ìdènà ìbáṣepọ̀. Lóòótọ́, àwọn obìnrin tí wọ́n bá àwọn ọkùnrin tí wọ́n ti parẹ́ EPP pọ̀ ní ìpele gíga (44.9%) ju àwọn obìnrin tí wọ́n ń ṣàkóso lọ (10.4%) nígbà tí wọ́n bá fara hàn sí àwọn ọkùnrin mìíràn (transgenic) (Àwòrán 3c). A tún kíyèsí ìdínkù pàtàkì nínú ìbímọ (Àwòrán 3d, òsì) àti ìdínkù díẹ̀ nínú iye ẹyin tí àwọn obìnrin wọ̀nyí gbé (Àwòrán 3d, àárín), nígbà tí ìpíndọ́gba ẹyin tí àwọn obìnrin gbé (ìdáhùn mìíràn tí ó fa nínú àwọn obìnrin nípa ìbáṣepọ̀)) kò ní ipa lórí (Àwòrán 3d, ọ̀tún). Nítorí pé a kíyèsí ìpele pàtó ti EPP fún 3D20E22P, àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé ìṣiṣẹ́ 3D20E nípasẹ̀ EPP tí a gbé nígbà ìbáṣepọ̀ lè ní ipa pàtàkì nínú pípa ìtẹ́wọ́gbà obìnrin sí ìbáṣepọ̀ síwájú sí i, ìwà kan tí a ti sọ tẹ́lẹ̀ nípa ìbímọ ti 20E. Nítorí náà, homonu ọkùnrin yìí tún ní ipa gidigidi lórí ìbímọ obìnrin.
Lẹ́yìn náà, a fi àwọn ìgbòkègbodò 20E àti 3D20E wéra nínú àwọn àyẹ̀wò abẹ́rẹ́ nínú àwọn wúńdíá tí wọ́n dàgbà nípa ìbálòpọ̀ nípa lílo 3D20E tí a ṣe kẹ́míkà (Àwòrán 4a–c) àti èyí tí ó wà ní ọjà 20E. A ṣàkíyèsí pé 3D20E múná dóko ju 20E lọ ní pípa ìmọ̀lára obìnrin sí ìbáṣepọ̀ ní àwọn ìṣọ̀kan méjèèjì (Àwòrán 4d). Lóòótọ́, ìdajì ìpele ìṣiṣẹ́ ara ti 3D20E nínú LRT (1,066 pg lẹ́yìn abẹ́rẹ́ vs. 2,022 pg lẹ́yìn abẹ́rẹ́) fa ìpín àwọn obìnrin tí kò lè fara dà tí ó ga ní ìlọ́po 20 ju ìpele ìṣiṣẹ́ ara ti 20E (361 pg lẹ́yìn abẹ́rẹ́) lọ ní wákàtí 24 lẹ́yìn abẹ́rẹ́ ní ìṣọ̀kan tí ó ga jùlọ 18 pg lẹ́yìn abẹ́rẹ́; Táblì Dátà Tí Ó Gún Sí I 1). Àbájáde yìí bá èrò náà mu pé ìyípadà ìbálòpọ̀ ti 20E kò fa àkókò ìfàmọ́ra, ó sì tún tọ́ka sí 3D20E gẹ́gẹ́ bí kókó pàtàkì nínú rírí i dájú pé ìbáṣepọ̀ òbí àti ọmọ. 3D20E tún ṣiṣẹ́ ju 20E lọ nínú àwọn àyẹ̀wò ìfọmọ ẹyin nínú àwọn obìnrin wúńdíá (Àwòrán 4e), èyí tó fihàn pé ìwọ̀n ìfọmọ ẹyin déédéé tí a ṣàkíyèsí lẹ́yìn ìdákẹ́jẹ́ EPP díẹ̀ jẹ́ nítorí wíwà ìṣiṣẹ́ 3D20E tí ó kù tí àwọn ohun tí ó ń fa ìbáṣepọ̀ obìnrin ń ṣe.
(a,b) 3D20E tí a ṣe nípasẹ̀ kẹ́míkà láti 20E (a) pẹ̀lú ìyípadà/ìṣiṣẹ́ gíga (ìwádìí tí a gbé kalẹ̀ gẹ́gẹ́ bí àròpín ± sem láti inú àwọn ìṣesí ìṣẹ̀dá mẹ́ta tí ó dá dúró) (b).c, Ìwọ̀n ìṣàn (ìdajì ìsàlẹ̀) bá ecdysone tí a rí nínú LRT abo tí a ti so pọ̀ (ìdajì òkè).d, Ní ìfiwéra pẹ̀lú 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Ìdánwò gangan Fisher, ẹ̀gbẹ́ méjì) àti 10% ethanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Ìdánwò gangan Fisher, ẹ̀gbẹ́ méjì), nígbà tí 20E ga ju ìdarí lọ ní àwọn ìwọ̀n gíga nìkan (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Ìdánwò gangan Fisher ìdánwò, ẹ̀gbẹ́ méjì).e, abẹ́rẹ́ 3D20E fa ìwọ̀n ìbímọ tó ga jù nínú àwọn obìnrin wúńdíá ju 10% àwọn ìṣàkóso ethanol lọ (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ìdánwò Fisher gangan, ẹ̀gbẹ́ méjì), nígbà tí 20E fiwé pẹ̀lú àwọn ìṣàkóso. Ní ìwọ̀n ìbímọ tó ga jù (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ìdánwò Fisher gangan, ẹ̀gbẹ́ méjì).3D20E fa ìwọ̀n ìbímọ tó ga jù 20E lọ ní ìwọ̀n ìbímọ tó ga jù (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ìdánwò Fisher gangan, ẹ̀gbẹ́ méjì). Nínú gbogbo àwọn páìnì, n dúró fún iye àwọn àpẹẹrẹ efon tó dá dúró fún ìṣẹ̀dá.NS, kìí ṣe pàtàkì.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Dáta wá láti inú àwọn àtúnṣe mẹ́ta.
Nínú àwọn ìwádìí ìṣáájú, a pinnu pé ìyípadà ìbálòpọ̀ ti àwọn homonu steroid ń fa ìfarahàn MISO (Ìbálòpọ̀-Ìmúdára ti Oogenesis 11), jínì ìbímọ obìnrin kan tí ó ń dáàbò bo àwọn obìnrin A. gambiae kúrò nínú àkóràn P. falciparum. Iye owó ìlera tí 13, kòkòrò àrùn malaria ènìyàn tí ó burú jùlọ, fà. Nítorí pàtàkì MISO sí ìlera ìbímọ àwọn Anopheles ní àwọn agbègbè tí malaria ti tàn kálẹ̀, a pinnu láti pinnu homonu 3D20E tàbí 20E tí ó ń fa ìfarahàn jínì yìí. A rí i pé nígbà tí abẹ́rẹ́ 20E ní pàtàkì tàbí tí ó lágbára jù bẹ́ẹ̀ lọ ń fa àwọn olugba homonu nuclear (HR), bíi HR3 àti HR4, àti àwọn ibi-afẹ́fẹ́ steroid tí ó wọ́pọ̀, bíi àwọn jínì yolkogenic Vg14, 15, 16, MISO ni 3D20E fà ní agbára púpọ̀ sí i (Àwòrán Ìdáhùn Tí A Gbéga Jùlọ 3). Nítorí náà, ìyípadà ìbálòpọ̀ ti homonu steroid androgenic yìí dàbí ẹni pé ó ń fa àwọn ọ̀nà tí ó ń dáàbò bo àwọn obìnrin kúrò nínú iye owó tí àkóràn parasitic ń fà. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, 3D20E ní ipa lórí àwọn isoforms méjèèjì ti EcR receptor, ó ń fa EcR-A àti fífún EcR-B ní ìdènà, ó sì tún ń fa àwọn jínì mìíràn tó ń fa ìbáṣepọ̀, títí kan HPX15, èyí tó ń nípa lórí ìbímọ obìnrin. Èyí lè ṣàlàyé àìlóyún tó ṣe pàtàkì tí a rí nínú àwọn obìnrin tó bá àwọn ọkùnrin tó ti pa EPP mọ́ (Àwòrán Ìdáhùn Tó Gbéṣẹ́ 3). Àwọn ìwádìí yìí dámọ̀ràn wíwà àwọn ipa ọ̀nà ìsàlẹ̀ tí àwọn homonu ecdysone méjì tó lè jẹ́ ìpìlẹ̀ iṣẹ́ ìbálòpọ̀ ń ṣiṣẹ́.
Lẹ́yìn náà, a dán iṣẹ́ àwọn jínì Eck méjì tí a ṣàwárí nínú ọ̀nà ìṣiṣẹ́ bioinformatics wa wò. Sísé EcK1 tàbí EcK2 yọrí sí ikú pàtàkì nínú àwọn ọkùnrin (Àwòrán Dátà Gíga 4a), èyí tí ó fihàn pé ecdysone phosphorylation, àti nítorí náà àìṣiṣẹ́, ṣe pàtàkì fún ìwàláàyè. Nítorí pé a fi EcK2 hàn ní àwọn ipele tí ó ga ju EcK1 lọ, a sì rí i nínú MAGs nípasẹ̀ proteomics (Àwòrán 2b,c àti Àfikún Táblì 2), a fìdí iṣẹ́ ecdysteroid kinase rẹ̀ múlẹ̀ nípa fífi 20E sínú rẹ̀, èyí tí ó yọrí sí phosphorylation 20E22P (Àwòrán Dátà Gíga 2).4b). Nígbà tí a ń lo 3D20E gẹ́gẹ́ bí ohun èlò ìṣàpẹẹrẹ, a kò lè rí ọjà phosphorylated 3D20E22P (Àwòrán Dátà Gíga 4c), èyí tí ó fihàn pé 20E dípò 3D20E lè jẹ́ ibi tí Eck2 fẹ́.
Gẹ́gẹ́ bí ìwádìí RNA-seq wa, EcK2 tún hàn gbangba nínú LRT ti àwọn obìnrin wúńdíá, níbi tí wọ́n ti pa á lẹ́yìn ìbáṣepọ̀ (Àwòrán 2b). A fìdí àwọn dátà wọ̀nyí múlẹ̀, a sì rí i dájú pé ìfúnni ẹ̀jẹ̀ kò ní ipa lórí ìṣàfihàn EcK2 (Àwòrán Dátà Tí Ó Gbéga Jù 5a). Nígbà tí a ń fẹ̀ sí àwọn ìdánwò MS àkọ́kọ́ wa, a rí i pé òkè 20E22P ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú òkè 20E (wákàtí 22-26 lẹ́yìn oúnjẹ ẹ̀jẹ̀; Àwòrán Dátà Tí Ó Gbéga Jù 5b). Dídádúró Eck2 nínú àwọn obìnrin wúńdíá yọrí sí ìbísí ní ìlọ́po mẹ́ta nínú ìpíndọ́gba ìbáṣepọ̀ ti 20E sí 20E22P ní wákàtí 26 lẹ́yìn oúnjẹ ẹ̀jẹ̀ (Àwòrán Dátà Tí Ó Gbéga Jù 2c àti 5c), èyí tí ó jẹ́rìí sí i pé Eck2 tún ní phosphorylates 20E nínú àwọn obìnrin. Ní pàtàkì, àwọn wúńdíá tí Eck2 ti parẹ́ pa mọ́ ní gbígbà ìbálòpọ̀ ní kíkún (Àwòrán Dátà Tí Ó Gbéga Jù 5d,e), èyí tí ó tún fihàn pé ìṣẹ̀dá obìnrin ti 20E kò fa àkókò àìfaradà ìbáṣepọ̀. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn wọ̀nyí Àwọn obìnrin ní ìwọ̀n ìfọ́ ẹyin pọ̀ sí i ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ìṣàkóso, pẹ̀lú ju 30% àwọn wundia tí wọ́n ń fi ẹyin sílẹ̀ lọ (Àwòrán Ìdáhùn Tí A Gbé Sókè 5f). Tí a bá ṣe abẹ́rẹ́ Eck2 RNA (dsEcK2) oní-orí méjì lẹ́yìn fífún ẹ̀jẹ̀ ní oúnjẹ, ìfọ́ ọmọ kò ṣẹlẹ̀, nígbà tí òkè 20E nítorí jíjẹ ẹ̀jẹ̀ ti dínkù. Ní gbogbogbòò, àwọn àbájáde wọ̀nyí ń ṣètìlẹ́yìn fún àpẹẹrẹ kan tí 20E tí a ṣe lẹ́yìn fífún ẹ̀jẹ̀ ní omi lè fa ìfọ́ ọmọ, ṣùgbọ́n nígbà tí a bá pa ìdènà ìfọ́ ọmọ (EcK2 àti bóyá àwọn ohun mìíràn) nípa ìbáṣepọ̀. Kò sí abẹ́rẹ́ 20E tàbí 3D20E tí ó dí ìfarahàn Eck2 nínú àwọn wundia lọ́wọ́ (Àwòrán Ìdáhùn Tí A Gbé Sókè 5g), èyí tí ó fihàn pé àwọn ohun mìíràn ń ṣe ìrànlọ́wọ́ fún ìdínà kinase yìí. Síbẹ̀síbẹ̀, ìwọ̀n 20E lẹ́yìn fífún ẹ̀jẹ̀ ní oúnjẹ kò tó láti fa ìdààmú ìbáṣepọ̀, ṣùgbọ́n àwọn títà gíga ti 3D20E tí a gbé ní ìbálòpọ̀ ló ń fa ìfọ́ ọmọ.
Àwọn àbájáde wa fún wa ní òye pàtàkì nípa àwọn ìlànà tí ó ń ṣàkóso àṣeyọrí ìbímọ ti A. gambiae. Àwòṣe kan ti yọjú níbi tí àwọn ọkùnrin ti yípadà láti ṣe àkójọpọ̀ àwọn ìwọ̀n gíga ti 3D20E, ecdysone tí a yípadà pàtó fún ọkùnrin kan tí ó ń rí i dájú pé àwọn òbí wọn ń di òbí nípa ṣíṣe àwọn obìnrin ní àìní ìmọ̀lára sí ìbáṣepọ̀ síwájú sí i. Ní àkókò kan náà, àwọn ohun tí ó ń fa àrùn ibà yìí tún ti ṣe àgbékalẹ̀ ètò tí ó munadoko láti mú 3D20E ṣiṣẹ́ nínú àwọn obìnrin ní ìdáhùn sí ìgbésẹ̀ ìbálòpọ̀ ti EPP pàtó fún ọkùnrin kan. Gẹ́gẹ́ bí a ti mọ̀, èyí ni àpẹẹrẹ àkọ́kọ́ ti ètò homonu steroid tí ọkùnrin àti obìnrin ń ṣàkóso tí ó ń ṣe iṣẹ́ àrà ọ̀tọ̀ àti pàtàkì nínú àwọn kòkòrò. A ti gbé iṣẹ́ ecdysone pàtó fún ọkùnrin kalẹ̀ ṣùgbọ́n a kò fi hàn ní pàtó. Fún àpẹẹrẹ, àbá tí a kò gbàgbọ́ 18 ni pé 20E precursor E1 lè ṣe àwọn iṣẹ́ wọ̀nyí. Ó jẹ́ mímọ̀ dáadáa pé ní Drosophila, monandry ni ó ń fa nípasẹ̀ ìgbésẹ̀ ìbálòpọ̀ ti àwọn peptides ìbálòpọ̀ kékeré19,20 tí ó ń bá àwọn neuron tí ń ṣe ìbímọ obìnrin lò nípasẹ̀ àwọn olugba peptide ìbálòpọ̀ pàtó21,22. Iṣẹ́ síwájú sí i ni a nílò láti pinnu àmì ìsàlẹ̀ àwọn cascades tí 3D20E ń ṣàkóso nínú àwọn abo A. gambiae àti láti pinnu bóyá àwọn cascades wọ̀nyí lè wà láàrín àwọn efon àti Drosophila.
Nítorí ipa pàtàkì ti 3D20E lórí ìbímọ obìnrin àti ìwà tí a ṣàfihàn nínú ìwádìí wa, àwọn ọ̀nà tí ó yọrí sí ìṣẹ̀dá àti ìṣiṣẹ́ 3D20E fúnni ní àwọn àǹfààní tuntun fún àwọn ọgbọ́n ìṣàkóso efon lọ́jọ́ iwájú, bíi ìṣẹ̀dá àwọn ọkùnrin onígbàdíje nínú àwọn ọgbọ́n ìmọ̀-ẹ̀rọ kòkòrò aláìlera. Lò fún ìtújáde egan tàbí láti fara wé 3D20E nínú eré wundia. Iṣẹ́ pàtó ti akọ ti 3D20E le ti yípadà nígbà tí A. gambiae àti àwọn ẹ̀yà Cellia mìíràn ní agbára láti so àtọ̀ wọn pọ̀ sínú àwọn ìsopọ̀ ìbáṣepọ̀, nítorí èyí gba ààyè fún ìgbésẹ̀ tó dára ti ọ̀pọ̀lọpọ̀ homonu àti àwọn enzymes tí ń mú kí homonu ṣiṣẹ́. Ní ọ̀nà kan náà, ìdàgbàsókè 3D20E tí ó ń lo monandry pèsè ìlànà kan fún àwọn obìnrin (nípasẹ̀ ìfihàn gíga ti MISO) láti ṣe ojúrere fún ìlera ìbímọ wọn ní àwọn agbègbè tí ibà maleria pọ̀ sí, èyí tí ó ń ṣe àfikún láìṣe tààrà sí ìtajáde Plasmodium. Nítorí pé a ti fihàn pé 20E obìnrin ní àwọn ipa jíjinlẹ̀ lórí ìwàláàyè àti ìdàgbàsókè P. falciparum nínú àwọn efon Anopheles obìnrin, 24 àti àwọn ipa hómónù steroid akọ àti abo ti di àwọn apá pàtàkì ti ìbáṣepọ̀ efon-parasite báyìí.
A. Àwọn irú ẹranko gambiae G3 ni a gbìn lábẹ́ àwọn ipò kòkòrò tí ó wọ́pọ̀ (26-28 °C, ọriniinitutu 65-80%, ìgbóná/òkùnkùn fún wákàtí 12:12). A fi oúnjẹ ẹja oníyẹ̀fun bọ́ àwọn Larvae (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets àti Tetra Pond Sticks ní ìpíndọ́gba 7:7:2). A fi omi dextrose 10% fún àwọn efon àgbàlagbà àti ẹ̀jẹ̀ ènìyàn lọ́sọ̀ọ̀sẹ̀ (ṣe àyẹ̀wò àwọn èròjà ẹ̀jẹ̀). A gba àwọn efon virgin nípa yíya àwọn abo sọ́tọ̀ ní ìpele pupal lẹ́yìn tí a bá ti ṣàyẹ̀wò àwọn ìpẹ̀kun wọn nípa lílo microscopy. A ti ṣàlàyé àwọn ọkùnrin tí wọ́n gbé transgene DsRed tẹ́lẹ̀.
A ṣe àwọn àdánwò ìbáṣepọ̀ tí a fipá mú ní ìbámu pẹ̀lú àwọn ìlànà tí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀. Fún ìbáṣepọ̀ àdánidá, a pa àwọn obìnrin wúńdíá ọlọ́jọ́ mẹ́rin mọ́ ní ìpíndọ́gba 1:3 pẹ̀lú àwọn ọkùnrin wúńdíá tí wọ́n ti dàgbà fún òru méjì. Fún àwọn àdánwò tí a fi abẹ́rẹ́ dsEPP fún àwọn ọkùnrin, ìdèpọ̀ ara-ẹni bá ọjọ́ 3-4 lẹ́yìn abẹ́rẹ́ mu, nígbà tí a pa ìṣiṣẹ́ phosphatase lẹ́nu mọ́ (Àwòrán Ìtọ́kasí 2b).
A ya àwọn àsopọ̀ efon, àwọn òkú tó kù (ìyókù ara), tàbí gbogbo ara ni a gé sí 100% methanol, a sì fi beader kan (2 mm gilasi beads, 2,400 rpm, 90 sec). Iye àsopọ̀ àti ìwọ̀n methanol ni a tẹ̀lé: ìyókù ara, 50 nínú 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT obìnrin, 25–50 80 µl. A fi ìtújáde methanol kejì yọ pẹ̀lú ìwọ̀n methanol kan náà. A fi centrifugation yọ àwọn ìdọ̀tí sẹ́ẹ̀lì kúrò. A da methanol láti inú ìyọkúrò méjèèjì pọ̀, a sì gbẹ ẹ́ lábẹ́ ìṣàn nitrogen, lẹ́yìn náà a tún dá a padà ní ìwọ̀n methanol 80% nínú omi: ìyókù ara, 50 µl; MAGs àti LRT obìnrin, 30 µl.
A ṣe àyẹ̀wò àwọn àpẹẹrẹ náà lórí mass spectrometer (ID-X, Thermo Fisher) tí a so mọ́ ohun èlò LC (Vanquish, Thermo Fisher). A fi 5 µl ti àpẹẹrẹ náà sí orí ọ̀wọ́n 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) tí a tọ́jú ní 25 °C. Àwọn ìpele alágbékalẹ̀ fún LC ni A (omi, 0.1% formic acid) àti B (acetonitrile, 0.1% formic acid). Ìwọ̀n LC náà nìyí: 5% B fún ìṣẹ́jú 1, lẹ́yìn náà a pọ̀ sí 100% B lórí ìṣẹ́jú 11. Lẹ́yìn ìṣẹ́jú 8 ní 100%, tún ṣe àtúnṣe ọ̀wọ̀n náà ní 5% B fún ìṣẹ́jú 4. Ìwọ̀n ìṣàn náà jẹ́ 0.3 ml min-1. A ṣe àṣeyọrí ionization nínú orísun MS nípa ionization electrospray gbígbóná ní àwọn ọ̀nà rere àti odi.
Oníwọ̀n ìṣàyẹ̀wò ibi-ìwọ̀n náà ń wọn dátà ní ìwọ̀n m/z láti 350 sí 680 ní ìpinnu 60,000 ní ipò MS pípé. A gba dátà MS/MS lórí [M + H]+ (gbogbo àwọn ibi-afẹ́de), [M - H2O + H]+ (gbogbo àwọn ibi-afẹ́de), àti [M - H]- (àwọn ibi-afẹ́de phosphorylated). A lo dátà MS/MS láti fìdí àwọn ohun-ìní ecdysone ti àwọn ibi-afẹ́de tí kò sí ìlànà fún. Láti dá àwọn ecdysteroid tí kò ní ìfọkànsí mọ̀, a ṣe àyẹ̀wò dátà MS/MS fún gbogbo àwọn òkè HPLC pẹ̀lú iye ìbátan tí ó ju 15% lọ. Ṣe ìṣirò nípa lílo àwọn ìlà ìwọ̀n tí a ṣẹ̀dá láti inú àwọn ìwọ̀n mímọ́ (20E, 3D20E) láti ṣe ìṣirò àwọn iye pípé tàbí ìfọ́pọ̀ ti àpẹẹrẹ pàtó kan (gbogbo àwọn ibi-afẹ́de mìíràn) láti ṣe ìṣirò ìbáramu wọn pẹ̀lú iye tí a rí nínú ọkùnrin kan. Fún 3D20E, a ṣe ìṣirò nípa lílo àpapọ̀ àwọn àdàpọ̀ wọ̀nyí: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. A fa àwọn dátà jáde, a sì ṣe ìwọ̀n wọn nípa lílo Tracefinder (ẹ̀yà 4.1). A ṣe àyẹ̀wò àwọn dátà MS/MS nípa lílo Xcalibur (ẹ̀yà 4.4). A fi àwọn ìrísí MS ti E, 20E àti 3D20E wé àwọn ìlànà tó yẹ. A ṣe àyẹ̀wò 3D20E22P nípa lílo ìyọrísí pẹ̀lú reagent Girard. A ṣe àyẹ̀wò 20E22P nípa lílo ìpíndọ́gba m/z.
A ti wẹ 3D20E22P mọ́ kúrò nínú MAG. A ṣe ìwẹ̀nùmọ́ lórí ìwọ̀n àyẹ̀wò nípa lílo chromatograph omi onípele ultra-performance (Acquity, Waters) pẹ̀lú ẹ̀rọ ìwádìí onípele quadrupole (QDa, Acquity, Waters) lábẹ́ àwọn ipò LC kan náà gẹ́gẹ́ bí ìwádìí HPLC-MS/MS. A bẹ̀rẹ̀ sí í kó ìpínyà jọ nígbà tí a rí m/z tí ó bá 3D20E22P mu ní àkókò ìpamọ́ kan náà gẹ́gẹ́ bí a ti pinnu tẹ́lẹ̀. Lẹ́yìn náà, a fi HPLC-MS/MS ṣàyẹ̀wò ìwẹ̀nùmọ́ àwọn èròjà tí a yọ jáde gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ lókè.
A yọ gbogbo RNA kuro ninu awọn àsopọ ibisi 10-12 tabi awọn ẹya ara miiran (alailopin ori) nipa lilo TRI reagent (Thermo Fisher) ni ibamu si awọn ilana olupese. A fi TURBO DNase (Thermo Fisher) tọju RNA. A fi cDNA ṣe agbekalẹ nipa lilo Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) ni ibamu si awọn ilana olupese. A ti tẹjade awọn alakoko fun reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR; Extended Data Table 2) tẹlẹ 24 tabi apẹrẹ nipasẹ lilo Primer-BLAST26, pẹlu ayanfẹ fun awọn ọja ti 70-150 bp ni iwọn ati awọn iyipo exon-exon ti o kọja tabi awọn alakoko Primer pair exons lọtọ. Awọn ayẹwo cDNA lati awọn alafọjade biological mẹta si mẹrin ni a fi omi pò ni igba mẹrin fun RT-qPCR. A ṣe iṣiro ni awọn afarawe atunṣe 15 µl ti o ni 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), awọn alafọ, ati 5 µl ti cDNA ti a ti dapọ. Awọn afarawe ṣiṣẹ lori A kó ètò PCR QuantStudio 6 Pro gidi-akoko (Thermo Fisher) àti àwọn dátà jọ, a sì ṣe àyẹ̀wò wọn nípa lílo Design and Analysis (version 2.4.3). Gẹ́gẹ́ bí a ti fihàn nínú ìwádìí yìí, a ṣe àtúnṣe iye àwọn nǹkan tó ní í ṣe pẹ̀lú jínì ribosomal RpL19 (AGAP004422), èyí tí ìrísí rẹ̀ kò yípadà ní pàtàkì pẹ̀lú fífún ẹ̀jẹ̀ ní oúnjẹ 27 tàbí ìbáṣepọ̀ 3.
A lo Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) lati ṣayẹwo didara RNA. A pese awọn ile-ikawe ti a so pọ mọ Illumina ni Broad Institute of MIT ati Harvard. A ṣe deede awọn kika ti a ṣeto si ara wọn si A. gambiae genome (PEST strain, version 4.12) nipa lilo HISAT2 (version 2.0.5) pẹlu awọn paramita aiyipada. A yọ awọn kika ti o ni didara mapping (MAPQ) <30 kuro nipa lilo Samtools (version 1.3.1). A ka iye awọn kika ti a ya si awọn jiini nipa lilo htseq-count (version 0.9.1) pẹlu awọn paramita aiyipada. A ṣe iṣiro awọn kika ti a ṣe deede ati itupalẹ ikosile jiini oriṣiriṣi nipa lilo package DESeq2 (version 1.28.1) ni R (version 4.0.3).
A dá àwọn tó ń yí ìjìnlẹ̀ Ecdysone padà mọ̀ nípa wíwá ìjìnlẹ̀ A. gambiae nípa lílo algoridimu PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), nípa lílo àwọn iye àìyípadà Àwọn pàrámítà pẹ̀lú àwọn ìtẹ̀léra prótéènì ìbéèrè wọ̀nyí: láti Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1), Musca domestica (Accession No. XP_005182020.1, XP_005175332.1 àti XP_011294434.1) àti Microplitus demolitor (Accession No. XP_008552646.1 àti XP_008552645.1) Eck láti B. mori (Accession No. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Accession No. NP_651202), Apis mellifera (Nọ́mbà Ìfàsẹ́yìn XP_394838) àti Acyrthosiphon pisum (Nọ́mbà Ìfàsẹ́yìn XP_001947166); àti EPP láti B. mori (Nọ́mbà Ìfàsẹ́yìn XP_001947166) NP_001177919.1 àti NP_001243996.1) àti EO ti D. melanogaster (Nọ́mbà Ìfàsẹ́yìn NP_572986.1) (ìgbésẹ̀ 1). Lẹ́yìn náà, àlẹ̀mọ́ náà ń dún ní ìbámu pẹ̀lú ìfarahàn mRNA gíga (>100 fragments/kilobase exons fún mílíọ̀nù àwọn ìwé tí a yàwòrán (FPKM) tàbí >85%) nínú àsopọ̀ ìbímọ (LRT obìnrin tàbí MAG) ní Gambia (ìgbésẹ̀ 2). Láti mú kí ìpele pàtó sunwọ̀n síi, a yan àwọn enzymu tí a lè yàn tí a tún lè rí nínú àsopọ̀ ìbímọ ti A. albimanus, irú àwọn anopheles kan tí kò ṣe àgbékalẹ̀ tàbí gbé ecdysone jáde nígbà ìbáṣepọ̀. A ṣe àlẹ̀mọ́ àwọn genes olùdíje ní ìbámu pẹ̀lú ìfarahàn kékeré (<100 FPKM tàbí <85th percentile) nínú àsopọ̀ ìbímọ A. albimanus (igbesẹ̀ 3). Gẹ́gẹ́ bí àlẹ̀mọ́ ìkẹyìn (igbesẹ̀ 4), àwọn genes olùdíje nílò láti tẹ́ ó kéré tán ọ̀kan lára ​​àwọn wọ̀nyí lọ́rùn: (1) a gbé e ga sí i lẹ́yìn ìbáṣepọ̀ (P < 0.05) gẹ́gẹ́ bí ìwádìí àwọn genes tí a lè fihàn ní ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ àti (2) nínú àwọn àsopọ̀ tí kì í ṣe ìbímọ (< 85% tàbí <100 FPKM).
A ṣe àtúnṣe sí àwọn ọ̀nà tí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀ 28,29,30 láti ṣe àṣeyọrí àmì isotopic gbogbo-ẹ̀dá. Ní kúkúrú, a dán Saccharomyces cerevisiae irú II (YSC2, Sigma) wò nínú ìpìlẹ̀ nitrogen iwukara (BD Difco, DF0335) tí ó ní (wt/vol) 2% glucose (G7528, Sigma), 1.7% amino acid-free àti ammonium sulfate. culture medium) àti 5% 15N ammonium sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) gẹ́gẹ́ bí orísun nitrogen kan ṣoṣo. A gba ìwúkàrà padà nípa centrifugation àti a fún àwọn ìdin efon ní ìfúnni ad libitum títí di ìgbà tí wọ́n bá dàgbà. A fi ẹja kún un (0.5 mg fún ìdin 300) láti dènà ikú ìbímọ kẹrin. Àwọn obìnrin nìkan ni a lò lẹ́yìn náà nínú àwọn àyẹ̀wò ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú àwọn ọkùnrin tí a kò fi àmì sí láti ṣàyẹ̀wò proteome ọkùnrin tí a gbé nígbà ìbáṣepọ̀.
Àwọn obìnrin wúńdíá tí wọ́n ní àmì 15N tí ọjọ́ mẹ́rin sí mẹ́fà jẹ́ ọmọ ọdún mẹ́fà ni a fipá mú láti bá àwọn ọkùnrin wúńdíá tí kò ní àmì ọjọ́ orí lò pọ̀. A fi ẹ̀rí hàn pé ìbáṣepọ̀ wọn yọrí sí rere nípa wíwá àwọn ohun èlò ìbáṣepọ̀ lábẹ́ ìwádìí afẹ́fẹ́ epifluorescence. Ní 3, 12, àti 24 hpm, a gé atria àwọn obìnrin tí wọ́n ní ìbáṣepọ̀ 45-55 sínú 50 µl ti ammonium bicarbonate buffer (pH 7.8) a sì fi pestle ṣe é. A fi centrifuge sí homogenate náà, a sì da supernatant pọ̀ mọ́ 50 µl ti 0.1% RapiGest (186001860, Waters) nínú 50 mM ammonium bicarbonate. A fi supernatant àti pellet láti inú àpẹẹrẹ kọ̀ọ̀kan di dìdì lórí yìnyín gbígbẹ, a sì fi ránṣẹ́ sí yàrá MacCoss ní University of Washington ní alẹ́ ọjọ́ kan, níbi tí a ti parí ìmúrasílẹ̀ àpẹẹrẹ fún LC-MS/MS. A tún fi 50 µl ti 0.1% RapiGest dá a nínú 50 mM ammonium bicarbonate àti sonicate nínú ìwẹ̀ omi. A wọ́n ìpele amuaradagba ti pellet àti supernatant nípa lílo àyẹ̀wò BCA, a dín àwọn àyẹ̀wò náà kù pẹ̀lú dithiothreitol 5 mM (DTT; Sigma), a fi alkylated pẹ̀lú 15 mM iodoacetamide (Sigma) a sì fi incubate sínú rẹ̀ ní 37 °C (1:0 50) fún wákàtí kan pẹ̀lú trypsinization: trypsin:substrate ratio). A fi RapiGest 200 mM HCl kún un, lẹ́yìn náà a fi incubate sínú rẹ̀ ní 37 °C fún ìṣẹ́jú 45 àti centrifugation ní 14,000 rpm fún ìṣẹ́jú 10 ní 4 °C láti mú àwọn ìdọ̀tí kúrò. A fọ àwọn àyẹ̀wò náà nípa yíyọ ìpele-méjì onípele-solid (Oasis MCX cartridges, Waters) a sì tún fi formic acid 0.1% kún un fún ìpele amuaradagba ìkẹyìn ti 0.33 µg µl-1. A ṣe àyẹ̀wò àwọn proteomes MAG tí kò ní àmì kan náà láti ọ̀dọ̀ àwọn ọkùnrin wúńdíá. A ṣe àyẹ̀wò àwọn àtúnṣe onínúró fún àpẹẹrẹ kọ̀ọ̀kan. Lẹ́yìn náà, a ṣe àyẹ̀wò 1 µg ti ọ̀kọ̀ọ̀kan nípa lílo ọ̀wọ̀n silica fused 25-cm 75-μm pẹ̀lú ìdẹkùn frit silica fused Kasil1 (PQ) 4-cm tí a fi Jupiter C12 reversed-phase reversed (Phenomenex) àti liquid chromatography ìṣẹ́jú 180 kún un. Àwọn ìṣàyẹ̀wò àpẹẹrẹ – A ṣiṣẹ́ MS/MS lórí Q-Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher) pẹ̀lú nanoACQUITY UPLC System (Waters). Àwọn ìṣàyẹ̀wò ìgbara tí ó ní í ṣe pẹ̀lú dátà tí a ṣe fún ìṣiṣẹ́ kọ̀ọ̀kan ni a yípadà sí ìrísí mzML nípa lílo Proteowizard (ẹ̀yà 3.0.20287) àti nípa lílo Comet31 (ẹ̀yà 3.2) lòdì sí ibi ìpamọ́ FASTA tí ó ní àwọn ìtẹ̀léra amuaradagba láti Anopheles gambiae (ẹ̀yà VectorBase 54), Anopheles coluzzi. A ṣe àwárí lórí Mali-NIH (ẹ̀yà VectorBase 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Oṣù Kẹta 2021), A. gambiae RNA-seq, àti ìtumọ̀ mẹ́ta ti àwọn èròjà ènìyàn tí a mọ̀. A pinnu àwọn FDR tí a bá map mu pẹ̀lú Peptide nípa lílo Percolator32 (ẹ̀yà 3.05) pẹ̀lú ààlà 0.01, a sì kó àwọn peptide jọ sínú ìdámọ̀ amuaradagba nípa lílo protein parsimony ní Limelight33 (ẹ̀yà 2.2.0). A ṣe ìṣirò iye amuaradagba tó jọra nípa lílo ohun tí a mọ̀ sí normalized spectral multiplicity factor (NSAF) tí a ṣírò fún protein kọ̀ọ̀kan ní ìṣiṣẹ́ kọ̀ọ̀kan gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ tẹ́lẹ̀. A ṣe àròpín NSAF ní ìbámu pẹ̀lú protein kọ̀ọ̀kan ní orí àwọn àpẹẹrẹ láti inú àwọn ohun èlò ìṣẹ̀dá ara méjì tó yàtọ̀ síra. 15N labeling bo proteome abo náà dáadáa, bó tilẹ̀ jẹ́ pé a lè rí iye protein díẹ̀ tí kò ní àmì láti ọ̀dọ̀ àwọn virgin tí a fi àmì sí. A ṣe àkọsílẹ̀ wíwá ìdínkù amuaradagba akọ (1-5 spectra) nínú àwọn àpẹẹrẹ aise abo nìkan ní ìṣiṣẹ́ ìmọ̀ ẹ̀rọ, níbi tí a ti ń ṣe àwọn àpẹẹrẹ aise lẹ́yìn àwọn àpẹẹrẹ akọ/ìbáṣepọ̀, nítorí HPLC “gbé kọjá”. Àwọn protein lẹ́ẹ̀kọ̀ọ̀kan tí a rí gẹ́gẹ́ bí ‘àwọn eléèérí’ láti inú àwọn virgin tí a fi àmì sí ni a kọ sínú Àtẹ Àfikún 1.
Àwọn peptide antigenic méjì, QTTDRVAPAPDQQQ (láàárin isotype PA) àti MESDGTTPSGDSEQ (láàárin isotype PA àti PB) nínú Genscript. A da àwọn peptide méjèèjì pọ̀, lẹ́yìn náà a so wọ́n pọ̀ mọ́ amuaradagba KLH tí ó ní ìdàgbàsókè, a sì fi sínú ehoro New Zealand. A fi àwọn ehoro rúbọ lẹ́yìn abẹ́rẹ́ kẹrin, a sì ya gbogbo IgG sọ́tọ̀ nípa ìwẹ̀nùmọ́ affinity. A lo IgG láti inú ehoro EPP tí ó pọ̀ jùlọ fún ìdàgbàsókè ìwọ̀ oòrùn síwájú sí i.
Fún àwọn ìpara ìwọ̀ oòrùn, MAG (n = 10, níbi tí n dúró fún iye àwọn àyẹ̀wò efon tí kò ní ìpalára nípa ti ẹ̀dá) àti LRT obìnrin (n = 30) láti ọ̀dọ̀ àwọn ọkùnrin wúńdíá ọjọ́ mẹ́rin àti àwọn obìnrin wúńdíá tàbí àwọn tí a fi agbára mú (<10 lẹ́yìn ìbáṣepọ̀), Prótéènì ìyọkúrò buffer (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× protease inhibitor cocktail (Roche)) ni a fi kún lọtọ̀ọ̀tọ̀. A ṣe àtúnṣe àwọn àyẹ̀wò lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ lẹ́yìn ìyọkúrò pẹ̀lú beader kan (2 mm gilasi beads, 2,400 rpm, 90 sec). A yọ àwọn ìdọ̀tí tí kò lè yọ́ kúrò nípa centrifugation ní 20,000 g ní 4 °C. A ṣe ìwọ̀n àwọn Prótéènì nípa lílo ìdánwò Bradford (Bio-Rad). Lẹ́yìn náà, 20 µg ti Prótéènì MAG, 40 µg ti Prótéènì LRT, àti 20 µg ti A fi 10% Bis-Tris NuPAGE ya àwọn èròjà amuaradagba tí ó kù sọ́tọ̀, a sì ya wọ́n sọ́tọ̀ nípa lílo MOPS buffer. A gbé àwọn èròjà protein lọ sí àwọn awọ ara polyvinylidene fluoride nípa lílo ètò ìyípadà iBlot2 (Thermo Fisher). A fọ àwọn awọ ara nígbà méjì nínú 1× PBS-T (0.1% Tween-20 nínú PBS) lẹ́yìn náà a dí wọn nínú Odyssey blocking buffer (Li-Cor) fún wákàtí kan ní 22°C. A mì àwọn awọ ara ní alẹ́ ní 4°C pẹ̀lú ààyò rabbit anti-EPP polyclonal primary antibody (1:700 nínú blocking buffer) àti rat anti-actin monoclonal primary antibody MAC237 (Abeam; 1:4,000). A fi PBS-T fọ àwọn awọ ara, a sì fi àwọn èròjà anti-secondary (donkey anti-rabbit 800CW àti goat anti-rat 680LT (Li-Cor), méjèèjì 1:20,000) sínú blocking buffer tí ó ní 0.01% SDS àti 0.2% Tween -20 fún wákàtí kan ní 22 °C. A fi PBS-T fọ àwọn awọ ara, a sì fi àwòrán Odyssey CLx ṣe àwòrán wọn. A kó àwọn àwòrán jọ, a sì ṣe àgbékalẹ̀ wọn nínú Image Studio (ẹ̀yà 5.2). A kò rí ìlà kan pàtó tó bá isoform EPP-RA (82 kDa) mu.
Àwọn agbègbè ìṣàkóṣo ti EPP (gẹ́gẹ́ bí isoform AGAP002463-RB tí ó ní domain histidine phosphatase, domain search NCBI conserved 34) àti Eck2 (AGAP002181) ni a ṣe àdàpọ̀ sínú pET-21a(+) plasmid (Novagen Millipore Sigma); Àwọn àkọ́lé ìpìlẹ̀ ni a kọ sí inú Táblì Dátà Tó gbòòrò sí 2. A fi àwọn ìjápọ̀ GS4 mẹ́jọ (ní ìdàpọ̀) sínú kí ó tó di C-terminal 6xHis tag ti pET-21a(+)-EcK2 construct. A ṣe àwọn protein recombinant nípa lílo NEBExpress cell-free E. coli protein synthesis reaction (New England BioLabs). A sọ àwọn protein recombinant di mímọ́ nípa lílo àwọn ọwọn spin NEBExpress Ni (New England BioLabs). A ṣe àwọn protein iṣakoso Dihydrofolate reductase (DHFR) nípa lílo àwòkọ DNA láti inú NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. A tọ́jú àwọn protein nínú 50% glycerol nínú PBS ní -20 °C fún oṣù mẹ́ta.
A wọn iṣẹ́ phosphatase ti EPP ati awọn àyọkà àsopọ ni lilo 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich). Àyọkà àyọkà náà ní 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ati 1 mM DTT. A so àsopọ naa pọ̀ mọ́ ara wọn ninu àyọkà ...
Fún ìṣiṣẹ́ Eck in vitro, a fi 0.2 mg 20E tàbí 3D20E sínú 200 µl buffer (pH 7.5) tí ó ní 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP àti 10 mM MgCl2 fún wákàtí méjì ní 27 °C. A dá ìṣesí náà dúró nípa fífi 800 µl methanol kún un, lẹ́yìn náà a tutù ní -20 °C fún wákàtí kan, lẹ́yìn náà a fi centrifuge sí 20,000 g fún ìṣẹ́jú mẹ́wàá ní 4 °C. Lẹ́yìn náà, a ṣe àyẹ̀wò supernatant náà nípasẹ̀ HPLC-MS/MS. Láti mú kí àwọn protein tí a lò nínú ẹgbẹ́ ìṣàkóso gbóná-gbóná, a fi àwọn protein náà sínú 50% glycerol nínú PBS fún ìṣẹ́jú 20 ní 95°C.
Fún ìṣiṣẹ́ EPP in vitro, a fi 3D20E22P (tó bá iye tí a rí nínú àwọn méjìlá MAG, tí HPLC-MS/MS ti sọ di mímọ́) sínú 100 µl buffer (pH 7.5) tí ó ní 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, àti 1 mM DTT fún wákàtí mẹ́ta ní 27 °C. A dá ìṣesí náà dúró nípa fífi 400 µl methanol kún un, a sì tutù ní -20 °C fún wákàtí kan, lẹ́yìn náà a fi centrifuge sí 20,000 g fún ìṣẹ́jú mẹ́wàá ní 4 °C. A ṣe àyẹ̀wò supernatant náà nípasẹ̀ HPLC-MS/MS.
Àwọn ègé PCR fún EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) àti EcK2 (556 bp) ni a mú pọ̀ sí i láti inú cDNA tí a pèsè láti inú àwọn òkú efon tí kò ní orí. A mú ègé PCR ti ìṣàkóso eGFP (495 bp) pọ̀ sí i láti inú pCR2.1-eGFP tí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀; Àwọn àkọ́lé PCR ni a kọ sínú Táblì Dátà Tó gbòòrò sí 2. A fi ègé PCR sínú láàrín àwọn olùgbékalẹ̀ T7 tó yí padà lórí plasmid pL4440. A gba àwọn ìkọ́lé Plasmid láti inú NEB 5-α tó ní agbára E. coli (New England Biolabs) a sì fi ìṣàyẹ̀wò DNA hàn kí a tó lò ó (wo Àfikún Dátà 1 fún ìṣàfihàn ìṣàfihàn). A lo àwọn àkọ́lé tí a bá T7 promoter (Táblì Dátà Tó gbòòrò sí 2) láti mú kí ìṣàfihàn náà pọ̀ sí i láti inú plasmid tó dá lórí pL4440. A fi agarose gel electrophoresis jẹ́rìí sí ìwọ̀n ọjà PCR. A kọ dsRNA láti inú àwọn àwòṣe PCR nípa lílo Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) a sì sọ ọ́ di mímọ́ gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè pẹ̀lú àwọn àtúnṣe tí a ṣàlàyé tẹ́lẹ̀.
Fún abẹ́rẹ́ dsRNA, a fún 1,380 ng ti dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ní ìwọ̀n 10 ng nl-1 sínú àyà àwọn ọkùnrin tàbí obìnrin àgbàlagbà (Nanoject III, Drummond) láàrín ọjọ́ kan lẹ́yìn ìtújáde. A pinnu ìwọ̀n ìtújáde jínì nínú ó kéré tán àwọn àtúnṣe ẹ̀dá mẹ́ta nípasẹ̀ ìyọkúrò RNA, ìṣẹ̀dá cDNA, àti RT-qPCR. Fún abẹ́rẹ́ ecdysone, a fún àwọn obìnrin tí wọ́n jẹ́ wúńdíá ọjọ́ mẹ́rin tàbí wúńdíá ọjọ́ mẹ́fà ní 0.13, 0.21, tàbí 0.63 µg ti 20E tàbí 3D20E (Nanoject III, Drummond) ní ìwọ̀n 1.3, 2.1, ní ìtẹ̀léra, ní ìbámu pẹ̀lú àpẹẹrẹ àyẹ̀wò tàbí 6.3 ng nl-1. A fún 100 nl ti 10% (vol/vol) ethanol nínú omi; 100 nl ti 3D20E22P ninu 10% ethanol (dogba si 75% ti iye ti a rii ninu awọn MAG meji). A pin awọn efon si ẹgbẹ abẹrẹ laileto.
Fún àwọn àyẹ̀wò ìbímọ, a fún àwọn obìnrin ọlọ́jọ́ mẹ́ta ní oúnjẹ ad libitum lórí ẹ̀jẹ̀ ènìyàn. Yọ àwọn efon tí a fún ní díẹ̀ tàbí tí a kò fún ní oúnjẹ kúrò. Gẹ́gẹ́ bí ìtọ́jú náà, a fi àwọn obìnrin sí inú agolo ìbímọ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ fún òru mẹ́rin ó kéré tán wákàtí 48 lẹ́yìn oúnjẹ ẹ̀jẹ̀. A ka ẹyin lábẹ́ stereoscope (Stemi 508, Zeiss); fún àwọn obìnrin tí wọ́n bá ti bá ara wọn mu, a kà ẹyin tí ó bá ti di ìdin sí ọmọ.
Fún àwọn ìdánwò ìbáṣepọ̀, a gbà àwọn obìnrin láàyè fún ọjọ́ méjì ó kéré tán, ó sinmi lórí ìtọ́jú náà láti ní ìdènà sí ìbáṣepọ̀, àti lẹ́yìn náà ni a fi àwọn ọkùnrin tí wọ́n jẹ́ irú-ọmọ-orí-ọmọ-orí-ọmọ sínú àgò kan náà. Ní òru méjì lẹ́yìn náà, a gé àwọn vesicles obìnrin tí a ti sọ di ọmọ-ọmọ jáde, a sì tú DNA genomic jáde nípa didi-thaw àti sonication nínú buffer tí ó ní 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, àti 25 mM NaCl (pH 8.2). A fi Proteinase K (0.86 µg µl-1) sínú àwọn àpẹẹrẹ fún ìṣẹ́jú 15 ní 55 °C, lẹ́yìn náà ni a fi ìṣẹ́jú 10 ní 95 °C. A fi àwọn ìpèsè DNA genomic tí a ti sọ di mímọ́ pọ̀ ní ìlọ́po mẹ́wàá, a sì fi wọ́n hàn láti rí àwọn ìtẹ̀léra krómósómù Y qPCR; a kọ àwọn primers sínú Táblì Dátà Tí Ó Gún Síi 2. Àìsí ìtẹ̀léra krómósómù Y fihàn pé kò sí ìbáṣepọ̀.
Fún àwọn àyẹ̀wò ìbáṣepọ̀ tuntun, a ṣe àyẹ̀wò àwọn obìnrin tí a fi agbára mú láti rí wíwà àwọn ohun èlò ìbáṣepọ̀ láti jẹ́rìí ipò ìbáṣepọ̀, a sì fún wọn ní ọjọ́ méjì láti ní ìfàmọ́ra sí ìbáṣepọ̀ láìsí àwọn ọkùnrin, gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀. 36. Lẹ́yìn náà, a gbé àwọn ọkùnrin tí ó ní sperm transgenic DsRed sínú àwọn àgọ́ obìnrin. Ní òru méjì lẹ́yìn náà, a gé àwọn vesicles tí ń fúnni ní ìfàmọ́ra kúrò lára ​​àwọn obìnrin, a sì pèsè DNA genomic gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ lókè, a sì fi àmì ìwádìí qPCR ti transgene DsRed hàn; a kọ àwọn primers sínú Àtẹ Ìdáhùn Tí Ó Gbòòrò 2. Àìsí transgene DsRed fihàn pé kò sí ìbáṣepọ̀ tuntun kankan.
A ṣe àgbékalẹ̀ 3D20E gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ tẹ́lẹ̀ 37. Ní kúkúrú, a yọ́ 10 mg ti 20E (Sigma-Aldrich) nínú omi 10 milimita, lẹ́yìn náà a fi 30 miligiramu ti platinum dúdú kún un (ní ìrísí lulú, Sigma-Aldrich). A máa ń fi omi díẹ̀díẹ̀ O2 sínú àdàpọ̀ ìṣe náà nígbà gbogbo, èyí tí a rú ní iwọ̀n otútù yàrá. Lẹ́yìn wákàtí mẹ́fà, a fi 30 milimita methanol kún un láti dá ìṣe náà dúró. A fi centrifuge sí àdàpọ̀ náà láti yọ àwọn èròjà catalyst kúrò. A tú omi náà jáde sínú iwọ̀n otútù yàrá. A tú omi náà jáde sínú iwọ̀n otútù 10% ethanol àti methanol fún abẹ́rẹ́ fún ìwádìí HPLC-MS/MS. Ìwọ̀n ìyípadà (láti 20E sí 3D20E) jẹ́ nǹkan bí 97% (Àwòrán 4b), àti ìrísí MS ti 3D20E tí a ṣe àgbékalẹ̀ báramu tí a rí nínú àwọn obìnrin tí wọ́n ti ṣe àgbékalẹ̀ (Àwòrán 4c).
Àròsọ náà ní àwọn kúlẹ̀kúlẹ̀ pàtó nípa àwọn ìdánwò ìṣirò tí a ṣe. A lo GraphPad (ẹ̀yà 9.0) láti ṣe ìdánwò Fisher gangan, ìdánwò Mantel-Cox, àti ìdánwò t-test ti Student's. A ṣe àwọn ìdánwò Cochran-Mantel-Haenszel nípa lílo ìwé àfọwọ́kọ R àṣà kan (tí ó wà ní https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). A dán pínpín dátà wò fún ìdúróṣinṣin nípa lílo ìdánwò Shapiro-Wilk pẹ̀lú ààlà pàtàkì ti 0.05. Nígbà tí dátà náà kùnà ìdánwò déédé, a ṣe ìdánwò Mann-Whitney. A ṣe àyẹ̀wò dátà ìpamọ́ nípa lílo ìdánwò Mantel-Cox. A lo àpò DESeq2 (ẹ̀yà 1.28.1) láti ṣe ìwádìí ìyàtọ̀ ìṣàfihàn ìpele RNA-seq. Ọ̀pá ìpele lórí àtẹ náà dúró fún àárín. Iye pàtàkì ti P = 0.05 ni a lò gẹ́gẹ́ bí ààlà fún gbogbo àwọn ìdánwò.
Fún ìwífún síi lórí àwòrán ìwádìí náà, wo àkótán Ìròyìn Ìwádìí Ìṣẹ̀dá tí a so mọ́ àpilẹ̀kọ yìí.
A fi data MS proteomic sinu ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) nipasẹ PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) pẹlu idanimọ data PXD032157.
A fi àkójọpọ̀ RNA-seq náà sínú Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) lábẹ́ àkójọpọ̀ ìtẹ̀léra GSE198665.
Àwọn àfikún ìwádìí tí a ṣẹ̀dá àti/tàbí tí a ṣàyẹ̀wò nígbà ìwádìí lọ́wọ́lọ́wọ́ ni a lè rí gbà láti ọ̀dọ̀ àwọn òǹkọ̀wé tí ó báramu nígbà tí a bá béèrè fún wọn. Àpilẹ̀kọ yìí pèsè ìwádìí orísun náà.
De Loof, A. Ecdysteroids: Àwọn steroid ìbálòpọ̀ kòkòrò tí a kò kà sí? Ọkùnrin: Àpótí Dúdú. Ìmọ̀ nípa Kòkòrò.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone àti ìdàgbàsókè ẹyin ọmọ nínú Anopheles stephens.J. Ìmọ̀ nípa Kòkòrò.28, 97–109 (1982).