Ìyàsọ́tọ̀ amuaradagba nínú ipa ọ̀nà ìkọ̀kọ̀ ṣe pàtàkì fún mímú ìpín sẹ́ẹ̀lì àti homeostasis mọ́. Yàtọ̀ sí ìyasọ́tọ̀ tí a ṣe pẹ̀lú ikarahun, ipa ti àwọn lipids nínú ìyasọ́tọ̀ kinesin nínú ilana gbigbe ìkọ̀kọ̀ jẹ́ ìbéèrè ìpìlẹ̀ tí ó ti wà fún ìgbà pípẹ́ tí a kò tí ì dáhùn. Níbí, a ṣe àwòrán onípele-gíga onípele-gíga 3D ní àkókò kan náà láti fihàn ní vivo pé àwọn protein tuntun tí a ṣe àgbékalẹ̀ glycosylphosphatidylinositol pẹ̀lú àwọn èròjà lipid ceramide gígùn gan-an ni a kójọpọ̀ tí a sì pín sí àwọn endoplasms pàtàkì. Net exit site, èyí tí ó yàtọ̀ sí èyí tí àwọn protein transmembrane lò. Ní àfikún, a fihàn pé gígùn pq ti ceramide nínú membrane endoplasmic reticulum ṣe pàtàkì fún yíyan yíyan yíyan. Ìwádìí wa pèsè ẹ̀rí tààràtà àkọ́kọ́ nínú vivo láti pín àwọn ẹrù amuaradagba tí ó dá lórí gígùn pq lipid sí àwọn ibi tí a yàn ní ipa ọ̀nà ìkọ̀kọ̀.
Nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì eukaryotic, a máa ń to àwọn prótíìnì tí a ṣe nínú endoplasmic reticulum (ER) nígbà tí a bá ń gbé wọn lọ nípasẹ̀ ọ̀nà ìkọ̀kọ̀ fún ìfijiṣẹ́ sí ibi tí wọ́n ń lọ sí sẹ́ẹ̀lì (1). Yàtọ̀ sí yíyọ ìfọwọ́sowọ́pọ̀ tí a fi àwọ̀ ṣe, a ti ń rò pé àwọn lipid kan lè ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí àwọn ibi ìjáde tí a yàn nípa pípín wọn sí àwọn agbègbè membrane pàtó tí àwọn prótíìnì pàtó (2-5). Síbẹ̀síbẹ̀, àìsí ẹ̀rí tààrà nínú vivo ṣì wà láti fi hàn pé ìlànà tí ó ṣeé ṣe yìí jẹ́ lipid. Láti lè yanjú ìṣòro ìpìlẹ̀ yìí, a kẹ́kọ̀ọ́ nínú ìwúkàrà bí a ṣe ń kó àwọn prótíìnì anchored glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GPI-APs) jáde láti ER ní ìyàtọ̀. GPI-APs jẹ́ oríṣiríṣi àwọn prótíìnì anchored cell surface proteins (6, 7). GPI-AP jẹ́ prótíìnì tí a tú jáde tí a so mọ́ àwọn ìwé pẹlẹbẹ òde ti plasma membrane nípasẹ̀ glycolipid moiety (GPI anchor). Wọ́n gba àwọn anchor GPI gẹ́gẹ́ bí àwọn àtúnṣe lẹ́yìn ìtumọ̀ nínú ER lumen (8). Lẹ́yìn ìsopọ̀mọ́ra, GPI-AP kọjá nípasẹ̀ ohun èlò Golgi (5, 9) láti ER sí àwọ̀ plasma. Wíwà àwọn ìdákọ̀ró GPI ń mú kí a gbé GPI-AP lọ sí ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ láti inú àwọn protein tí a ti tú jáde transmembrane (pẹ̀lú àwọn protein membrane plasma mìíràn) ní ọ̀nà ìkọ̀kọ̀ (5, 9, 10). Nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì ìwúkàrà, a ya àwọn GPI-APs sọ́tọ̀ kúrò nínú àwọn protein mìíràn tí a ti tú jáde nínú endoplasmic reticulum, lẹ́yìn náà a kó wọn sínú àwọn vesicles aláìlẹ́gbẹ́ tí a fi coat protein complex II (COPI) dì (6, 7). Àwọn ohun tí ó ń pinnu ìlànà ìsọ̀rí yìí nínú ìlànà ìtajà ER kò yé wa, ṣùgbọ́n a rò pé ìlànà yìí lè nílò àwọn lipids, pàápàá jùlọ àtúnṣe ìṣètò ti apá lipid ti ìdákọ̀ró GPI (5, 8). Nínú ìwúkàrà, àtúnṣe lipid GPI bẹ̀rẹ̀ lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ lẹ́yìn tí GPI bá so mọ́, àti ní ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìgbà, ó ń mú kí ceramide so mọ́ 26-carbon long-chain saturated fatty acid (C26:0) (11, 12). C26 ceramide ni ceramide pàtàkì tí àwọn sẹ́ẹ̀lì ìwúkàrà ń mú jáde títí di ìsinsìnyìí. A ń ṣe é nínú ER, a sì ń kó ọ̀pọ̀lọpọ̀ rẹ̀ jáde sí ẹ̀rọ Golgi nípasẹ̀ àwọn vesicles COPII (13). Ìtajà ER ti GPI-AP nílò ìṣẹ̀dá ceramide tí ń lọ lọ́wọ́ (14, 15), àti ní ìyípadà, ìyípadà ceramide sí inositol phosphate ceramide (IPC) nínú ẹ̀rọ Golgi sinmi lórí ìṣẹ̀dá anchor GPI (16). Àwọn ìwádìí biophysical pẹ̀lú àwọn awo artificial ti fihàn pé àwọn ceramides chain acyl gígùn gan-an le para pọ̀ láti ṣẹ̀dá àwọn agbègbè tí a ṣètò pẹ̀lú àwọn ohun-ìní ti ara àrà ọ̀tọ̀ (17, 18). Àwọn ìwádìí wọ̀nyí yọrí sí àbá náà pé ceramide C26 àti GPI-AP pẹ̀lú ceramide C26 ń lo àwọn ohun-ìní ti ara wọn láti para pọ̀ sínú àwọn agbègbè tàbí agbègbè tí ó wà ní àyíká lipid membrane ER tí ó bàjẹ́. Ó jẹ́ ní pàtàkì láti inú glycerolipids kúkúrú àti tí kò ní àjẹyó (C16:1 àti C18:1) (19, 20). Àwọn agbègbè wọ̀nyí ni a ó yàn láti fojú sí àwọn ibi ìjáde ER pàtó (ERES), níbi tí a ti lè gbé ceramide àti GPI-AP tí ó jẹ́ ti ceramide pọ̀ sí Golgi nínú ìkòkò COPII kan náà (5).
Nínú ìwádìí yìí, a ti dán ọ̀nà ìṣiṣẹ́ lipid yìí wò tààrà nípa lílo super-resolution confocal real-time imaging microscopy (SCLIM), èyí tí í ṣe ọ̀nà ìwádìí onípele-gíga kan tí ó lè ṣe àkíyèsí àwọn èròjà fluorescent tí a fi àmì sí ní àkókò kan náà. Àwọn àwòrán aláwọ̀ mẹ́ta àti oníwọ̀n mẹ́ta (3D) ní ìpele gíga àti iyàrá tó ga jùlọ nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì alààyè (21, 22).
A kọ́kọ́ lo ìmọ̀ ẹ̀rọ SCLIM láti ṣàlàyé bí a ṣe ń ṣe àyẹ̀wò GPI-AP déédéé pẹ̀lú ẹgbẹ́ ceramide C26 láti inú àwọn èròjà transmembrane tí a tú jáde lẹ́yìn tí a fi ER sílẹ̀ nínú S. cerevisiae. Láti ṣàyẹ̀wò ìpínsísọ̀rí ER, a lo ètò ìbílẹ̀ kan tí ó lè fojú inú wo ẹrù tuntun tí a ṣe àgbékalẹ̀ rẹ̀ tí ó wọ inú ERES in vivo (7, 23). Gẹ́gẹ́ bí ẹrù, a yan C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 tí a fi àmì sí pẹ̀lú èròjà fluorescent alawọ ewe (GFP) àti èròjà transmembrane tí a tú jáde Mid2 tí a fi àmì sí pẹ̀lú èròjà fluorescent nitosi infrared (iRFP), àwọn méjèèjì ni a fojú sí awọ ara plasma (24–26). Nínú ìyípadà tí ó ní ìmọ̀lára ìgbóná sec31-1, àwọn ẹrù méjì wọ̀nyí ni a fi hàn lábẹ́ olùgbékalẹ̀ galactose-inducible àti àmì ERES constitutive. Ní ìgbóná líle (37°C), nítorí pé ìyípadà sec31-1 ní ipa lórí iṣẹ́ ti èròjà coat COPII Sec31 láti dènà ìbísí COPII àti ìtajà ER, ẹrù tuntun tí a tú jọ ń kó jọ ní ER (23). Lẹ́yìn tí ó tutù dé ìwọ̀n otútù díẹ̀ (24°C), àwọn sẹ́ẹ̀lì oníyípadà sec31-1 tí a rí gbà láti agbègbè ìkọ̀kọ̀, àti pé ẹrù oníṣọ̀nà tuntun tí a kó jọ bẹ̀rẹ̀ sí í kó jáde láti ER. Ìwòran CLIM fihàn pé ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn Gas1-GFP àti Mid2-iRFP tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ ṣe àgbékalẹ̀ ṣì ń kó jọ nínú ER ti àwọn sẹ́ẹ̀lì oníyípadà sec31-1 lẹ́yìn ìdènà ní 37°C lẹ́yìn náà wọ́n sì tú u sílẹ̀ ní 24°C fún ìṣẹ́jú 5 (Àwòrán 1). Níwọ́n ìgbà tí a pín Mid2-iRFP sí gbogbo àwọ̀ ER, àti pé Gas1-GFP wà ní ìṣọ̀kan tí a sì kó jọ ní agbègbè àwọ̀ ER tí kò dúró ṣinṣin, ìpínkiri wọn yàtọ̀ pátápátá (Àwòrán 1, A sí C àti Movie S1). Ní ​​àfikún, gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn ní Àwòrán 1D, àkójọ Gas1-GFP kò ní Mid2-iRFP. Àwọn èsì wọ̀nyí fihàn pé a pín àwọn amuaradagba GPI-AP àti transmembrane sí àwọn agbègbè àwọ̀ ER tí ó yàtọ̀ ní ìbẹ̀rẹ̀. Ẹgbẹ́ Gas1-GFP wà ní ẹ̀gbẹ́ ERES pàtó kan tí a fi àmì sí pẹ̀lú prótínì ìbòrí mCherry's COPII Sec13 (Àwòrán 1, E àti F, àti fíìmù S1) (23).
Àwọn sẹ́ẹ̀lì sec31-1 ń fi àwọn ìtújáde tí galactose fà hàn, ẹ̀wọ̀n acyl gígùn kan (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, aláwọ̀ ewé) àti protein transmembrane Mid2-iRFP (TMP, aláwọ̀ búlúù) àti àmì ERES Constructive yìí ni a fi Sec13-mCherry (ERES, magenta) sínú ní 37°C fún ìṣẹ́jú 30, a gbé e sí 24°C, a sì fi SCLIM yàwòrán rẹ̀ ní ìṣẹ́jú 5 lẹ́yìn náà. (A sí C) fi àwòrán 2D kan tí a so pọ̀ tàbí tí a so pọ̀ hàn ti plane (A), àwòrán 2D ti àwọn ìpín z 10 (B) tàbí àwòrán 3D cell hemisphere ti ẹrù àti àwọn àmì ERES (C). Pẹpẹ 1μm (A àti B). Ẹ̀yà scale náà jẹ́ 0.551μm (C). A rí Gas1-GFP ní àwọn agbègbè ER tàbí àwọn ìṣùpọ̀ ER tí ó yàtọ̀, nígbà tí a rí Mid2-iRFP tí a sì pín káàkiri membrane ER (C). (D) Àwòrán náà fi agbára ìtànṣán Gas1-GFP àti Mid2-iRFP hàn nínú ìṣọ̀kan Gas1-GFP ní ẹ̀gbẹ́ ìlà ọfà funfun (òsì). AU, ẹ̀yà àìdánimọ̀. (E àti F) dúró fún àwòrán 3D tí ó so àwọn ọjà àti àmì ERES pọ̀. A rí àwọn ìṣọ̀kan Gas1-GFP nítòsí ERES pàtó kan. Ẹ̀yà ìwọ̀n náà jẹ́ 0.551μm. (F) Ọfà funfun tí ó lágbára ló ń ṣàfihàn ìṣọ̀kan Gas1-GFP tí ó ní í ṣe pẹ̀lú ERES. Àwọn pánẹ́lì àárín àti ọ̀tún fi àwòrán 3D tí a ti wọ́pọ̀ tí ó sì ń yípo hàn àti ìran tí a ti yípo ti ìṣọ̀kan Gas1-GFP tí a yàn.
Àjọṣepọ̀ tó ṣọ̀kan láàárín Gas1-GFP cluster àti ERES pàtó kan fihàn pé Gas1-GFP lè wọ inú ERES tí a yàn, èyí tí ó yàtọ̀ sí yíyàn tí Mid2-iRFP lò láti fi ER sílẹ̀. Láti yanjú èyí, a ṣe ìṣirò ìpíndọ́gba ERES fún ọjà kan tàbí méjì nìkan (Àwòrán 2, A sí C). A rí i pé ọ̀pọ̀lọpọ̀ ERES (70%) ní irú ẹrù kan ṣoṣo. Àwòrán ìsàlẹ̀ ti Àwòrán 2C fi àpẹẹrẹ méjì tí ó wọ́pọ̀ ti ERES pẹ̀lú Gas1-GFP nìkan (Àwòrán 1) tàbí Mid2-iRFP nìkan (Àwòrán 2) hàn. Ní ìyàtọ̀ sí èyí, nǹkan bí 20% ti ERES ní ẹrù méjì tí ó wọ́pọ̀ ní agbègbè kan náà. A rí i pé àwọn ERES kan (10%) ní oríṣi ẹrù méjì, ṣùgbọ́n wọ́n ya wọ́n sọ́tọ̀ ní àwọn agbègbè tí ó yàtọ̀ síra. Nítorí náà, ìwádìí ìṣirò yìí fihàn pé lẹ́yìn tí a bá ti kó ER jáde, a pín GPI-AP Gas1-GFP àti ẹrù transmembrane Mid2-iRFP sí oríṣiríṣi ERES (Àwòrán 2D). Ìṣiṣẹ́ yíyàsọ́tọ̀ yìí bá ìṣàyẹ̀wò kẹ́míkà (6) àti ìpinnu ìrísí ara mu (7). A tún lè kíyèsí ìṣesí ẹrù tí a yà sọ́tọ̀ tí ó ń wọ ERES (Àwòrán 2E àti Fíìmù S2). Àwòrán 2E fihàn pé apá kékeré kan ti Gas1-GFP (páálí 3) tàbí Mid2-iRFP (páálí 4) nìkan ni ó ń wọ ERES láti ẹ̀gbẹ́ kan ó sì wà ní agbègbè kan pàtó. Àwòrán 5 ti Àwòrán 2E fihàn pé Gas1-GFP àti Mid2-iRFP ni a máa ń rí nígbà míì ní ERES kan náà, ṣùgbọ́n wọ́n ń wọlé láti ẹ̀gbẹ́ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ wọ́n sì wà ní àwọn agbègbè ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ tí ó lè dúró fún onírúurú vesicles COPII. A tún jẹ́rìí sí i pé ìyàsọ́tọ̀ àti ìsọ̀rí CPI-AP Gas1 tí a ṣàkíyèsí gẹ́gẹ́ bí ERES tí a yàn jẹ́ pàtó nítorí pé ẹrù ìtújáde transmembrane mìíràn, protein plasma membrane protein tí GFP fi àmì sí Axl2 (27), tí ó ń fi ìwà kan náà hàn sí Mid2-iRFP. (Àwòrán S1 àti Fíìmù S3). A pin Axl2-GFP tuntun ti a ṣe agbekalẹ nipasẹ awo ara ER bii Mid2-iRFP (Àwòrán S1, A ati B), a si so Mid2-iRFP pọ mọ ara wọn ninu ọpọlọpọ awọn ERES (Àwòrán S1, B si D). Awọn panẹli 1 ati 2 ti Àwòrán 1. S1C fihan awọn apẹẹrẹ ERES ti o wọpọ nibiti awọn ẹru transmembrane meji ti n bo ara wọn. Ninu awọn ọran wọnyi, awọn ẹru mejeeji wọ ERES papọ (Àwòrán S1E, Panel 3 ati Movie S3).
Àwọn sẹ́ẹ̀lì sec31-1 tí wọ́n ń ṣàfihàn ìtújáde galactose inducible, Gas1-GFP (GPI-AP, ewé) àti Mid2-iRFP (TMP, búlúù) àti àmì ERES tí ó jẹ́ ti Sec13-mCherry (ERES, magenta) ni a gbé sí 37 Lẹ́yìn tí a bá ti fi sínú iná fún ìṣẹ́jú 30 ní °C, gbé e sí 24 °C láti tú ìdènà ìtújáde náà sílẹ̀, kí o sì fi àwòrán náà hàn pẹ̀lú SCLIM lẹ́yìn ìṣẹ́jú 20. (A sí C) Àwọn àwòrán ìfihàn 2D tí a ṣe àfihàn (A; ọ̀pá ìwọ̀n, 1μm) tàbí àwọn àwòrán 3D cell hemisphere (B àti C; ìwọ̀n ìwọ̀n, 0.456μm) ti ẹrù àti àwọn ìpín z 10 tí a fi ERES sàmì sí. Pẹpẹ ìsàlẹ̀ nínú (B) àti pẹpẹ nínú (C) ń ṣàfihàn àwọn àwòrán tí a ṣe àgbékalẹ̀ láti fi àwọn ọjà tí ó wà nínú ERES (magenta) [Gas1-GFP (grẹy) àti Mid2-iRFP (bulu fẹ́lẹ́fẹ́lẹ́)] nìkan hàn. (C) Ọfà ṣíṣí: ERES nikan ni o n gbe ẹrù kan ṣoṣo (1 sí 4). Ọfà ewé: ERES ni ẹrù ti a ya sọtọ (5). Ọfà funfun ti o lagbara: ERES ti o ni ẹrù ti a gbe papọ. Ni isalẹ: ERES kan ti a yan ni Gas1-GFP (1) tabi Mid2-iRFP (2) nikan. Ọpá iwọn, 100 nm. (D) Iye ti photomicrograph ti a ṣalaye ninu (C). Ogorun apapọ ti ERES ti o ni ẹrù kan ṣoṣo (Gas1-GFP tabi Mid2-iRFP), ẹrù ti a ya sọtọ ati ẹrù ti o ni idapọmọra. Ninu awọn idanwo ominira mẹta, n=432 ninu awọn sẹẹli 54. Ọpá aṣiṣe = SD. Idanwo t ti ko ni iru meji. *** P = 0.0002. (E) Aworan 3D ti awọn ERES ti a yan ti ẹrù ti a ya sọtọ ti a samisi pẹlu (C). Gas1-GFP (alawọ ewe) (3) tabi Mid2-iRFP (buluu) (4) wọ ERES (magenta) lati ẹgbẹ kan o si ni opin si agbegbe kekere kan laarin ERES. Nígbà míìrán, irú ẹrù méjèèjì máa ń wọ ERES (5) kan náà láti ẹ̀gbẹ́ kan náà, wọ́n sì máa ń wà ní agbègbè kan tí ó dá dúró láàárín ERES. Ìwọ̀n ìpele, 100 nm.
Lẹ́yìn náà, a dán àbá kan wò pé gígún acyl chain ceramide (C26) tó wà nínú membrane ER ń darí ìṣọ̀kan àti yíyàtọ̀ Gas1 sí àwọn ERES tí a yàn. Láti ṣe èyí, a lo irú ìwúkàrà tí a yípadà GhLag1, nínú èyí tí a fi GhLag1 (àmì owu Lag1) rọ́pò àwọn synthases ceramide endogenous méjì Lag1 àti Lac1, èyí tó yọrí sí ìwúkàrà ìwúkàrà pẹ̀lú ẹ̀yà sẹ́ẹ̀lì Ceramide kúrú ju irú ìwúkàrà lọ (Àwòrán 3A) (28). Ìwádìí Mass spectrometry (MS) fihàn pé nínú àwọn ẹ̀yà ìwúkàrà ìwúkàrà, 95% ti gbogbo ceramide jẹ́ ceramide chain (C26), nígbàtí ní GhLag1, 85% ti ceramide gùn gan-an (C18 àti C16). ), 2% ti ceramide nìkan ni ó gùn gan-an (C26) chain ceramide. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn ceramides C18 àti C16 ni àwọn ceramide pàtàkì tí a rí nínú awo GhLag1 títí di ìsinsìnyí, àyẹ̀wò MS tún jẹ́rìí sí i pé ohun ìdámọ̀ràn GPI ti Gas1-GFP tí a fihàn nínú eya GhLag1 ní ceramide C26, èyí tí ó jọ àwọn lipid irú wild-type. Dídára rẹ̀ kan náà (Àwòrán 3A) (26). Nítorí náà, èyí túmọ̀ sí wípé enzyme àtúnṣe ceramide Cwh43 jẹ́ àṣàyàn gidigidi fún ceramide C26, gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn ní Àwòrán 26, ó ní ìfẹ́ láti fi ìdámọ̀ràn GPI láti inú ìwọ̀n kékeré ti ceramide C26 nínú eya GhLag1 kún un. S2 (29). Síbẹ̀síbẹ̀, awo sẹ́ẹ̀lì ti GhLag1 ní ceramide C18-C16 nìkan, nígbà tí Gas1-GFP ṣì ní ceramide C26. Òtítọ́ yìí mú kí irú yìí jẹ́ ohun èlò tí ó dára jùlọ láti yanjú ìṣòro gígùn ẹ̀wọ̀n acyl ti membrane ceramide nínú ER. Ipa àbájáde ti ìpele àti ìtòjọ. Lẹ́yìn náà, a kọ́kọ́ kẹ́kọ̀ọ́ nípa agbára C26 Gas1-GFP láti kó jọ sínú àwọn ìṣùpọ̀ nínú GhLag1 pẹ̀lú allele mutant tí ó ní ìmọ̀lára ìgbóná ti sec31-1 nípasẹ̀ microscopy fluorescence ìbílẹ̀, níbi tí ẹ̀wọ̀n gígùn (C18-C16) nìkan wà nínú membrane ER Ceramide (Àwòrán 3). A ṣe àkíyèsí pé ní sec31-1, ọ̀pọ̀lọpọ̀ Gas1-GFP ni a kó jọ sínú àwọn ìṣùpọ̀, nígbà tí Gas1-GFP nínú sec31-1 GhLag1 pẹ̀lú membrane ER ceramide gígùn (C18-C16) kò ní ìṣùpọ̀ púpọ̀ tí a sì pín in nínú gbogbo membrane ER. Láti jẹ́ òótọ́, nítorí pé ìṣùpọ̀ tí ó dá lórí ceramide C26 ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú ERES pàtó kan (Àwòrán 1), a tẹ̀lé e ṣe ìwádìí bóyá ìlànà yìí tún lè ní ipa nínú iṣẹ́ ti ẹ̀rọ amuaradagba ìtajà ER. GPI-AP ń lo ètò COPII pàtàkì kan fún ìtajà ER, èyí tí a ń ṣe àtúnṣe ìṣètò Ted1 ti apá glycan ti anchor GPI (30, 31). Lẹ́yìn náà, a máa dá GPI-glycan tí a tún ṣe àtúnṣe mọ̀ nípasẹ̀ transmembrane cargo receptor p24 complex, èyí tí ó máa ń yan Lst1 láti yan, èyí tí ó jẹ́ ìsopọ̀ pàtó kan nínú COPII cargo binding subunit Sec24, tí ó ń ṣe àwọn vesicles COPII ọlọ́rọ̀ GPI-AP (31-33). Nítorí náà, a ṣe àtúnṣe onípele méjì kan tí ó so ìparẹ́ àwọn protein kan ṣoṣo wọ̀nyí pọ̀ (ẹ̀yà p24 complex complex Emp24, GPI-glycan remodeling enzyme Ted1 àti COPII subunit Lst1 pàtó) pẹ̀lú sec31-1 mutant strain, a sì kẹ́kọ̀ọ́ wọn. Ṣé ó ṣeé ṣe láti ṣẹ̀dá Gas1-cluster GFP (Àwòrán 3). A ṣe akiyesi pe ninu sec31-1emp24Δ ati sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP ko ni akojọpọ pupọ ati pinpin jakejado awo ara ER, gẹgẹ bi a ti rii tẹlẹ ninu sec31-1 GhLag1, lakoko ti o wa ninu sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Bii sec31-1. Awọn abajade wọnyi fihan pe ni afikun si wiwa ceramide C26 ninu awo ara ER, iṣakojọpọ Gas1-GFP tun nilo lati so mọ eka p24, ati pe ko nilo igbanisiṣẹ Lst1 kan pato. Lẹhinna, a ṣawari iṣeeṣe pe gigun ẹwọn ti ceramide ninu awo ara ER le ṣe ilana isopọ Gas1-GFP si p24. Sibẹsibẹ, a rii pe wiwa ceramide C18-C16 ninu awo ara ko ni ipa lori GPI-glycans ti eka p24 tun ṣe (Awọn aworan S3 ati S4, A ati B) tabi asopọ mọ GPI-AP ati gbigbe agbara GPI-AP jade. Gba COPII subtype Lst1 (Àwòrán S4C). Nítorí náà, ìṣọ̀pọ̀ C26 ceramide-dependent kò nílò ìbáṣepọ̀ amuaradagba pẹ̀lú onírúurú àwọn ọ̀nà ìtajà amuaradagba ER, ṣùgbọ́n ó ń ṣètìlẹ́yìn fún ọ̀nà ìtajà mìíràn tí a ń darí nípasẹ̀ gígùn lipid. Lẹ́yìn náà, a ṣe àyẹ̀wò bóyá gígùn ẹ̀wọ̀n ceramide acyl nínú àwọ̀ ara ER ṣe pàtàkì fún ìpínsọ́tọ̀ Gas1-GFP tí ó munadoko gẹ́gẹ́ bí ERES tí a yàn. Níwọ́n ìgbà tí Gas1 nínú ìṣàn GhLag1 pẹ̀lú ceramide oní-ẹsẹ̀ kúkúrú fi ER sílẹ̀ tí ó sì wọ inú àwọ̀ ara plasma (Àwòrán S5), a gbàgbọ́ pé tí gígùn ẹ̀wọ̀n ceramide acyl bá ń darí ìpínsọ́tọ̀ náà, a lè darí Gas1 nínú àwọ̀ ara GhLag1 kí a sì kọjá rẹ̀. Àwọn ọjà ERES pẹ̀lú àwọ̀ ara kan náà.
(A) Àwọ̀ ara sẹ́ẹ̀lì GhLag1 ní àwọn ceramides C18-C16 kúkúrú ní pàtàkì, nígbàtí ìdákọ́ró GPI ti Gas1-GFP ṣì ní C26 IPC kan náà gẹ́gẹ́ bí àwọn sẹ́ẹ̀lì irú wild-type. Lókè: ìṣàyẹ̀wò gígùn ẹ̀wọ̀n acyl ti ceramide nínú àwọ̀ ara sẹ́ẹ̀lì ti àwọn irú wild-type (Wt) àti GhLag1p nípasẹ̀ ìṣàyẹ̀wò mass spectrometry (MS). Ìṣàyẹ̀wò náà dúró fún ìpín ọgọ́rùn-ún gbogbo ceramide. Àròpín àwọn ìṣàyẹ̀wò mẹ́ta aláìdámọ̀. Àwọ̀ error bar = SD. Ìdánwò t aláìdámọ̀ méjì. **** P ＜0.0001. Àwòrán ìsàlẹ̀: Ìṣàyẹ̀wò MS ti gígùn ẹ̀wọ̀n acyl ti IPC tí ó wà nínú ìdákọ́ró GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) tí a fihàn nínú àwọn irú wild-type àti GhLag1p. Ìdánwò náà dúró fún ìpín ọgọ́rùn-ún gbogbo àmì IPC. Àròpín àwọn ìṣàyẹ̀wò aláìdámọ̀ márùn-ún. Àwọ̀ error bar = SD. Ìdánwò t aláìdámọ̀ méjì. ns, kò ṣe pàtàkì. P = 0.9134. (B) Àwọn sẹ́ẹ̀lì Fluorescence ti sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ àti sec31-1lst1Δ tí ó ń ṣàfihàn Gas1-GFP tí galactose fà ni a fi sínú iná ní 37°C fún ìṣẹ́jú 30, a sì fi wọ́n sílẹ̀ láti ṣe ìwádìí ìwádìí fluorescence déédéé lẹ́yìn 24°C. Ọfà funfun: ER Gas1-GFP cluster. Ọfà ṣíṣí: A kò ní ìdìpọ̀ Gas1-GFP tí a pín káàkiri gbogbo àwọ̀ ara ER, tí ó ń fi àmì ìrísí òrùka nuclear tí ó jẹ́ ti ER hàn. Ìwọ̀n ìpele, 5μm. (C) Ìwọ̀n fọ́tòmicrograph tí a ṣàlàyé nínú (B). Ìpíndọ́gba ìpíndọ́gba àwọn sẹ́ẹ̀lì pẹ̀lú ìṣètò Gas1-GFP punctate. Nínú àwọn ìdánwò mẹ́ta tí ó dá dúró, àwọn sẹ́ẹ̀lì n≥300. Ìlànà àṣìṣe = SD. Ìdánwò t tí kò ní ìrù méjì. **** P ＜0.0001.
Láti yanjú ìṣòro yìí tààrà, a ṣe ìwòran SCLIM ti Gas1-GFP àti Mid2-iRFP nínú GhLag1 pẹ̀lú sec31-1 allele mutant-sensitive temperature-sensitive (Àwòrán 4 àti Movie S4). Lẹ́yìn tí a ti pa ER mọ́ ní 37°C tí a sì tún tú u jáde ní 24°C, ọ̀pọ̀lọpọ̀ Gas1-GFP tuntun tí a ṣe àkójọpọ̀ kò sí ní ìṣọ̀kan tí a sì pín káàkiri membrane ER, gẹ́gẹ́ bí a ṣe rí i nípasẹ̀ àwọn microscopes ìbílẹ̀ (Àwòrán 4, A àti B). Ní ​​àfikún, ìpíndọ́gba ńlá ti ERES (67%) ní oríṣi ẹrù méjì tí a so pọ̀ nínú rẹ̀ (Àwòrán 4D). Àwọn paneli 1 àti 2 ti Àwòrán 4C fi àpẹẹrẹ méjì tí ó wọ́pọ̀ ti ERES pẹ̀lú Gas1-GFP tí ó wọ́pọ̀ àti Mid2-GFP hàn. Ní àfikún, a kó àwọn ọjà méjèèjì jọ sínú ERES kan náà (Àwòrán 4E, panel 3 àti movie S4). Nítorí náà, àwọn àbájáde wa fihàn pé gígùn ẹ̀wọ̀n acyl ceramide nínú membrane ER jẹ́ ohun tí ó ṣe pàtàkì fún ìṣọ̀kan àti ìṣọ̀kan protein ER.
Àwọn sẹ́ẹ̀lì GhLag1 Sec31-1 tí ń ṣàfihàn àwọn ìtújáde tí galactose fà, Gas1-GFP (GPI-AP, aláwọ̀ ewé) àti Mid2-iRFP (TMP, aláwọ̀ búlúù) àti Sec13-mCherry (ERES, magenta) tí ó ní àmì ERES nínú rẹ̀. Tẹ̀síwájú fún ìṣẹ́jú 30, sọ̀kalẹ̀ sí 24°C láti tú àwọn ìtújáde jáde, kí o sì ya àwòrán pẹ̀lú SCLIM lẹ́yìn ìṣẹ́jú 20. (A sí C) Àwọn àwòrán ìfihàn 2D aṣojú (A; ọ̀pá ìwọ̀n, 1μm) tàbí àwọn àwòrán 3D sẹ́ẹ̀lì hemisphere (B àti C; ìwọ̀n ìwọ̀n, 0.45μm) ti àwọn ìpín z 10 tí a fi ẹrù àti ERES sàmì sí. Pẹẹ̀lì ìsàlẹ̀ nínú (B) àti pẹẹ̀lì nínú (C) ń ṣàfihàn àwọn àwòrán tí a ti ṣe àgbékalẹ̀ láti fi àwọn ọjà tí ó wà nínú ERES (magenta) [Gas1-GFP (grẹy) àti Mid2-iRFP (blúù fẹ́ẹ́rẹ́fẹ́) hàn nìkan. (C) Ọfà funfun tí ó kún: ERES, àwọn ọjà tí ó fara jọra. Ọfà ṣíṣí: ERES ní ohun kan ṣoṣo. Pánẹ́lì ìsàlẹ̀: ERES tí a yàn ní àwọn ọjà tí ó bò ara wọn (1 àti 2) tí a sàmì sí ní (C). Pánẹ́lì ìwọ̀n, 100 nm. (D) Ìwọ̀n fọ́tòmikrófọ́ọ̀fù tí a ṣàlàyé nínú (C). Nínú àwọn ẹ̀yà GhLag1 sec31-1 àti sec31-1, ẹrù kan ṣoṣo (Gas1-GFP tàbí Mid2-iRFP) ni a fi kún un, àti ìpíndọ́gba ìpíndọ́gba ti ERES fún ẹrù tí a yà sọ́tọ̀ àti ẹrù tí ó bò ara wọn. Nínú àwọn ìdánwò mẹ́ta tí ó dá dúró, n = 432 nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì 54 (sec31-1) àti n = 430 nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì 47 (sec31-1 GhLag1). Pánẹ́lì àṣìṣe = SD. Ìdánwò t tí kò ní ìrù méjì. *** P = 0.0002 (sec31-1) àti ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Àwòrán 3D ti ERES tí a yàn pẹ̀lú ẹrù tí ó bò ara wọn (3) tí a sàmì sí nínú (C). Gas1-GFP (alawọ ewe) ati Mid2-iRFP (bulu) n sunmọ ERES (magenta) lati ẹgbẹ kanna ati duro ni agbegbe ERES ti a fi opin si. Iwọn iwọn, 100 nm.
Ìwádìí yìí fúnni ní ẹ̀rí tààrà nínú ara ẹni pé a pín àwọn ẹrù amuaradagba tí ó dá lórí lipid sí àwọn ibi tí a yàn láti kó jáde ní ipa ọ̀nà ìkọ̀kọ̀, ó sì fi hàn pé gígùn ẹ̀wọ̀n acyl ṣe pàtàkì fún yíyan ìpínsísọ̀rí. Nípa lílo ọ̀nà microscopy alágbára àti òde-òní tí a ń pè ní SCLIM, a fi Gas1-GFP tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ ṣe àgbékalẹ̀ rẹ̀ hàn (GPI-AP membrane plasma pàtàkì kan pẹ̀lú ẹ̀wọ̀n acyl gígùn (C26) ceramide lipid part) nínú ìwúkàrà). Àwọn agbègbè tí a kó jọ ní àwọn ER aláìlẹ́gbẹ́ ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú ERES pàtó kan, nígbà tí àwọn protein tí a tú jáde transmembrane ni a pín káàkiri àwọ̀ ER (Àwòrán 1). Ní ​​àfikún, àwọn irú ọjà méjì wọ̀nyí ń wọ oríṣiríṣi ERES ní yíyàn (Àwòrán 2). Gígùn ẹ̀wọ̀n acyl ti ceramide sẹ́ẹ̀lì nínú àwọ̀ náà dínkù láti C26 sí C18-C16, a da ìdìpọ̀ Gas1-GFP rú sínú agbègbè ER aláìlẹ́gbẹ́, a sì tún da Gas1-GFP padà láti fi ER sílẹ̀ pẹ̀lú protein transmembrane nípasẹ̀ ERES kan náà (Àwòrán 3 àti Àwòrán 3). 4).
Bó tilẹ̀ jẹ́ pé GPI-AP ń lo ètò prótínì pàtàkì láti jáde kúrò nínú ER, a rí i pé ìyàsọ́tọ̀ tí ó gbẹ́kẹ̀lé ceramide C26 kò gbára lé àwọn ìbáṣepọ̀ prótínì tó yàtọ̀ tí ó lè yọrí sí àkànṣe ERES (Àwòrán S4 àti S5). Dípò bẹ́ẹ̀, àwọn àwárí wa ń ṣètìlẹ́yìn fún ètò ìṣọ̀kan mìíràn tí ìṣọ̀kan prótínì tí ó dá lórí lipid àti ìyọkúrò àwọn ẹrù mìíràn lẹ́yìn náà ń darí. Àwọn àkíyèsí wa fihàn pé agbègbè Gas1-GFP tàbí ìṣọ̀kan tí ó ní í ṣe pẹ̀lú ERES pàtó kan kò ní prótínì tí a ti tú jáde nínú transmembrane Mid2-iRFP, èyí tí ó fihàn pé ìṣọ̀kan GPI-AP tí ó gbẹ́kẹ̀lé ceramide C26 yóò mú kí wọ́n wọ inú ERES tí ó yẹ, àti ní àkókò kan náà, wọn yóò yọ transmembrane kúrò. Àwọn ìtújáde náà wọ inú ERES pàtó yìí (Àwòrán 1 àti 2). Ní ​​ìyàtọ̀ sí èyí, wíwà àwọn ceramide C18-C16 nínú membrane ER kò fa kí GPI-AP ṣe àwọn agbègbè tàbí àwọn ìṣọ̀kan, nítorí náà wọn kò yọ tàbí rọ́pò àwọn prótínì tí a tú jáde nínú transmembrane sínú ERES kan náà (Àwòrán 3 àti 4). Nítorí náà, a dámọ̀ràn pé C26 ceramide ń darí ìyàsọ́tọ̀ àti ìpínsọ́tọ̀ nípa ṣíṣe ìrànlọ́wọ́ fún ìṣọ̀kan àwọn protein tí ó sopọ̀ mọ́ ERES pàtó kan.
Báwo la ṣe lè ṣe àṣeyọrí ìṣọ̀kan C26 tí ó gbára lé ceramide sínú agbègbè ER kan pàtó? Ìtẹ̀sí láti ya ceramide membrane sí ìta lè fa kí GPI-AP àti C26 ceramide ṣẹ̀dá àwọn lipid kéékèèké àti lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ ní àyíká lipid tí kò bá ìlànà mu ti membrane ER tí ó ní àwọn glycerolipids kúkúrú àti tí kò kún. Àwọn ìṣọ̀kan dídára (17, 18). Àwọn ìṣọ̀kan ìgbà díẹ̀ kékeré wọ̀nyí ni a lè tún so pọ̀ mọ́ àwọn ìṣọ̀kan ńlá àti tí ó dúró ṣinṣin lẹ́yìn tí a bá ti so mọ́ complex p24 (34). Ní ​​ìbámu pẹ̀lú èyí, a fihàn pé C26 Gas1-GFP nílò láti bá complex p24 lò láti ṣẹ̀dá àwọn ìṣọ̀kan tí ó tóbi tí a lè rí (Àwòrán 3). Complex p24 jẹ́ heterozygous oligomer tí ó ní àwọn protein transmembrane p24 mẹ́rin tí ó yàtọ̀ síra nínú iwukara (35), èyí tí ó pèsè ìsopọ̀ multivalent, èyí tí ó lè yọrí sí ìsopọ̀pọ̀ àwọn ìṣọ̀kan GPI-AP kéékèèké, nípa bẹ́ẹ̀ ó ń mú ìṣọ̀kan Stable tí ó tóbi (34). Ìbáṣepọ̀ láàárín àwọn ectodomains amuaradagba ti GPI-APs tún lè ṣe àfikún sí ìṣọ̀pọ̀ wọn, gẹ́gẹ́ bí a ti fihàn nígbà tí wọ́n ń gbé Golgi wọn sínú àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial onígbà-ẹranko (36). Síbẹ̀síbẹ̀, nígbà tí ceramide C18-C16 bá wà nínú membrane ER, nígbà tí complex p24 bá so mọ́ Gas1-GFP, àwọn ìṣùpọ̀ ńláńlá tí ó yàtọ̀ síra kò ní ṣẹ̀dá. Ìlànà ìpìlẹ̀ náà lè sinmi lórí àwọn ohun-ìní ti ara àti kẹ́míkà pàtó ti ceramide chain acyl long. Àwọn ìwádìí biophysical ti àwọn membranes artificial fihàn pé bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn ceramides chain acyl long (C24) àti kukuru (C18-C16) le fa ìyàsọ́tọ̀ ìpele, àwọn ceramides chain acyl long (C24) nìkan ló le gbé ìtẹ̀sí gíga àti títẹ̀ fíìmù lárugẹ láti tún ṣe àtúnṣe fíìmù náà. Nípasẹ̀ ìtọ́kasí ara-ẹni (17, 37, 38). A ti fihan pe helix transmembrane ti TMED2, homologue eniyan ti Emp24, n ṣe ajọṣepọ pẹlu sphingomyelin ti o da lori C18 ceramide ninu awọn lobules cytoplasmic (39). Nipa lilo awọn iṣeṣiro molikula (MD), a rii pe awọn ceramides C18 ati C26 n kojọ ni ayika awọn lobules cytoplasmic ti helix transmembrane Emp24, wọn si ni awọn ayanfẹ kanna (Aworan S6). O ṣe pataki lati ṣe akiyesi pe eyi tọka si pe helix transmembrane ti Emp24 le ja si pinpin aimi ti awọn lipids ninu awo naa. Eyi jẹ abajade tuntun ti o da lori awọn sẹẹli ẹranko. Awọn iṣeṣiro MD kanna tun fihan wiwa awọn lipids ether (40). Nitorinaa, a ṣe akiyesi pe ceramide C26 ninu awọn lobules meji ti ER26 ni a ti ni ọlọrọ ni agbegbe. Nígbà tí GPI-AP nínú àwọn lobules luminal bá so mọ́ multivalent p24 tààrà àti pé ìkójọpọ̀ C26 ceramide ní àyíká p24 nínú àwọn lobules cytoplasmic, ó lè gbé ìṣọ̀kan Prótéènì tí ó tẹ̀lé e lárugẹ àti pé ìyípo membrane ni a ń ṣẹ̀dá láti inú àwọn ìka ọwọ́ (41), èyí tí ó ń mú kí GPI-AP pín sí àwọn agbègbè tí ó yàtọ̀ sí ERES, èyí tí ó tún ń ṣe ojúrere fún àwọn agbègbè tí ó yípadà gíga ti membrane ER (42). Àwọn ìròyìn tí ó ti kọjá ti ṣètìlẹ́yìn fún ìlànà tí a dábàá (43, 44). Ìsopọ̀ multivalent ti oligolectins, pathogens tàbí antibodies sí glycosphingolipids (GSL) tí ó wà lórí membrane plasma ń fa ìṣọ̀kan GSL ńlá, ó ń mú kí ìpínyà àkókò pọ̀ sí i, ó sì ń fa ìyípadà membrane àti internalization (44). Iwabuchi àti bẹ́ẹ̀ bẹ́ẹ̀ lọ (43) A rí i pé nígbà tí àwọn ẹ̀wọ̀n acyl gígùn (C24) ṣùgbọ́n tí kò kúrú (C16) bá wà, ligand multivalent tí a so mọ́ GSL lactosylceramide ló fa ìṣẹ̀dá àwọn àkójọpọ̀ ńlá àti ìfàmọ́ra awọ ara, àti pé ìyípadà àmì tí a fi ọwọ́ ṣe nípasẹ̀ cytoplasm Lyn lórí àwọn ìwé kékeré náà ni àwọn ẹ̀wọ̀n acyl nínú àwọn neutrophils tí a so pọ̀ ń yípo.
Nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial onígbà-ẹranko, ìṣọ̀kan nẹ́tíwọ́ọ̀kì anti-Golgi (TGN) sí ìpele àwọ̀ ara plasma apical ló ń darí ìyàsọ́tọ̀ àti yíyàsọ́tọ̀ GPI-AP (10, 45). Ìṣàpọ̀ yìí ni GPI-AP oligomerization ń darí (36), ṣùgbọ́n ó tún lè sinmi lórí gígùn ẹ̀wọ̀n ceramide tí a rí nínú ìwúkàrà. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé GPI-AP onígbà-ẹranko ní anchor tí ó dá lórí ether lipid, àti pé ìṣètò kẹ́míkà rẹ̀ yàtọ̀ sí ceramide ẹ̀wọ̀n acyl gígùn gan-an, ìwádìí kan láìpẹ́ yìí fi hàn pé àwọn lipid méjèèjì ní àwọn ohun-ìní ti ara àti kẹ́míkà tí ó jọra ní ìdàgbàsókè àti iṣẹ́ (40). Nítorí náà, apá lipid ether nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì onígbà-ẹranko lè jọ ceramide C26 nínú ìwúkàrà, ipa rẹ̀ sì ni láti so pọ̀ mọ́ ceramide ẹ̀wọ̀n gígùn nínú àwọ̀ ara láti gbé ìṣọ̀pọ̀ àti yíyàsọ́tọ̀ GPI-AP lárugẹ. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ó ṣì yẹ kí a dán an wò tààrà, àwọn àwárí ìṣáájú fìdí múlẹ̀ pé kì í ṣe àwọn èròjà ìyípadà cytoplasmic ló ń gbé ceramide ẹ̀wọ̀n acyl gígùn lọ sí ara Golgi, ṣùgbọ́n ó sinmi lórí ìṣẹ̀dá àwọn ìdákọ̀ró GPI bíi ìwúkàrà. Nítorí náà, ó dà bíi pé ìlànà ìyípadà ìyípadà lè sopọ̀ mọ́ ìpèsè ceramide ẹ̀wọ̀n acyl gígùn àti GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) nínú vesicle ìtọ́jú kan náà.
Nínú àwọn ètò sẹ́ẹ̀lì epithelial oníwúrà àti ẹranko oníwúrà, àpapọ̀ GPI-AP àti ìyàsọ́tọ̀ láti inú àwọn èròjà ìbòrí plasma míràn gbogbo wọn ló máa ń wáyé kí wọ́n tó dé ojú sẹ́ẹ̀lì náà. Paladino àti àwọn ẹlẹgbẹ́ rẹ̀ (48) rí i pé lórí TGN ti àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial oníwúrà oníwúrà, ṣíṣàkójọ GPI-AP kìí ṣe pàtàkì fún ìpínyà yíyàn ti GPI-APs sí àwọ̀ plasma apical nìkan, ṣùgbọ́n ó tún ń ṣe àkójọpọ̀ ìṣètò ti GPI-APs àti ìṣiṣẹ́ rẹ̀. Ojú sẹ́ẹ̀lì. Nínú ìwúrà, ìwádìí yìí fihàn pé àwọ̀ GPI-AP oníwúrà ... Sibẹsibẹ, idanwo siwaju sii boya a ti ṣeto eto iṣẹ-ṣiṣe ti oju sẹẹli lati ER nipasẹ ọna tito lẹsẹsẹ ti o da lori gigun lipid yoo jẹ koko-ọrọ iwadii wa ọjọ iwaju.
Àwọn irúgbìn Saccharomyces cerevisiae tí a lò nínú iṣẹ́ yìí ni a kọ sínú Táblì S1. Àwọn irúgbìn MMY1583 àti MMY1635 ti SCLIM fún àwòrán sẹ́ẹ̀lì alààyè ni a kọ́ ní ẹ̀yìn W303. Àwọn irúgbìn wọ̀nyí tí ń ṣàfihàn Sec13-mCherry pẹ̀lú àmì amuaradagba fluorescent ni a fi ọ̀nà polymerase chain reaction (PCR) ṣe pẹ̀lú pFA6a plasmid gẹ́gẹ́ bí àpẹẹrẹ (23). A ṣe irúgbìn tí ń ṣàfihàn Mid2-iRFP tí a fi protein fluorescent ṣe àmì lábẹ́ ìdarí GAL1 promoter gẹ́gẹ́ bí àtẹ̀lé yìí. Ìmúdàgba PCR ti ìtẹ̀lé iRFP-KanMx láti inú vector pKTiRFP-KAN (ẹ̀bùn E. O'Shea, nọ́mbà plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; idámọ̀ àwọn ohun èlò ìwádìí (RRID): Addgene_64687) A sì fi sínú C-terminus ti endogenous Mid2 Mid2. Lẹ́yìn tí a ti mú ìtẹ̀léra ìrísí Mid2-iRFP pọ̀ sí i tí a sì ti ṣe àdàkọ rẹ̀ sínú olùgbékalẹ̀ GAL1, a fi sínú ojú-ọ̀nà Not I-Sac I ti ìṣọ̀kan plasmid pRS306. A fi Pst I ṣe ìlà plasmid pRGS7 tí ó jáde láti fi ṣepọ sínú ojú-ọ̀nà URA3.
A fi ìṣàfihàn jínì Gas1-GFP hàn lábẹ́ ìdarí olùgbékalẹ̀ GAL1 nínú plasmid centromere (CEN), èyí tí a ṣe gẹ́gẹ́ bí a ṣe kọ ọ́. A fi PCR mú ìtẹ̀lé Gas1-GFP pọ̀ sí i láti inú plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (ẹ̀bùn L. Popolo) a sì fi ìṣàfihàn sínú ibi Xma I–Xho I ti plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (ẹ̀bùn C). Miller; Nọ́mbà plasmid Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). A pe plasmid tí ó jáde ní pRGS6. A tún fi ìṣàfihàn jínì Axl2-GFP hàn lábẹ́ ìdarí olùgbékalẹ̀ GAL1 ti fíìmù pBEVY-GL LEU2, ìṣètò rẹ̀ sì nìyí. A ṣe àfikún ìtẹ̀lé Axl2-GFP láti inú pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plasmid (23) nípasẹ̀ PCR, a sì ṣe àdàkọ rẹ̀ sínú ojú òpó Bam HI-Pst I ti pBEVY-GL LEU2 vector. A pe plasmid tí ó jáde ní pRGS12. Ìtẹ̀lé àwọn oligonucleotides tí a lò nínú ìwádìí yìí ní àkójọpọ̀ nínú Táblì S2.
A fi adenine 0.2% àti glucose 2% [YP-dextrose (YPD)] kún irúgbìn náà, protein raffinose [YP-raffinose] rich yeast extract protein p (YP) alabọde (1% Yeast extract àti protein ept 2%). (YPR)] tàbí galactose 2% [YP-galactose (YPG)] gẹ́gẹ́ bí orísun erogba, tàbí nínú minimally synthetic medium (0.15% yeast nitrogen base àti 0.5% ammonium sulfate) láti fi kún amino acids àti ìpìlẹ̀ tó yẹ fún oúnjẹ, Àti pé ó ní 2% glucose (sintetic glucose minimally medium) tàbí 2% galactose (sintetic galactose minimaly medium) gẹ́gẹ́ bí orísun erogba.
Fún àwòrán ní àkókò gidi, àwọn sẹ́ẹ̀lì oníyípadà sec31-1 tí ó ní ìgbóná ara tí ó ń ṣàfihàn ìṣẹ̀dá lábẹ́ olùgbékalẹ̀ GAL1 ni a gbìn sí àárín YPR ní 24°C ní alẹ́ títí dé àárín ìpele. Lẹ́yìn ìfàsẹ́yìn YPG ní 24°C fún wákàtí kan, a fi SG sínú 37°C fún ìṣẹ́jú 30, lẹ́yìn náà a gbé wọn lọ sí 24°C láti tú wọn sílẹ̀ láti inú ìdènà ìtújáde. A lo Concanavalin A láti so àwọn sẹ́ẹ̀lì náà mọ́ orí ìṣàn gilasi kan tí a sì yàwòrán rẹ̀ nípasẹ̀ SCLIM. SCLIM jẹ́ àpapọ̀ ohun èlò amúṣẹ́dá fìríìsì Olympus IX-71 tí a yí padà àti lẹ́ńsì epo onípele UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), ìwọ̀n iyàrá gíga àti ìwọ̀n imúṣẹ́dá lílo ẹ̀rọ amúṣẹ́dá fídíò confocal (Yokogawa Electric), spectrometer àdáni, àti ìtútù àdáni. Agbára àwòrán ètò náà (Hamamatsu Photonics) lè pèsè ètò lẹ́ńsì amúṣẹ́dá pẹ̀lú ìgbéga ìkẹyìn ti ×266.7 àti kámẹ́rà ẹ̀rọ amúṣẹ́dá tí ó ń sọ àwọn elektron di púpọ̀ (Hamamatsu Photonics) (21). Softwaya àdáni ni a ṣe láti gba àwòrán. Fún àwọn àwòrán 3D, a lo ohun èlò amúṣẹ́dá piezoelectric tí a ṣe àdáni láti gbọn lẹ́ńsì amúṣẹ́dá náà ní inaro, a sì kó àwọn ẹ̀yà opitika náà jọ ní 100 nm sí ara wọn nínú àkójọ kan. A yí àwòrán Z-stack padà sí data voxel 3D, a sì lo iṣẹ́ ìtànkálẹ̀ point spread tí a lò fún microscope confocal disk tí ń yípo fún ìṣiṣẹ́ deconvolution nípasẹ̀ software Volocity (PerkinElmer). Nípa lílo software Volocity láti ṣe ààlà fún ìṣàyẹ̀wò ibi-alápapọ̀, a wọn ERES pẹ̀lú ẹrù. A ṣe ìṣàyẹ̀wò line scan nípa lílo software MetaMorph (Molecular Devices).
Lo sọftuwia GraphPad Prism lati pinnu pataki iṣiro. Fun idanwo t-akẹẹkọ onigun meji ati idanwo ọna kan ti o wọpọ ti iyatọ (ANOVA), awọn iyatọ laarin awọn ẹgbẹ ni a gba pe o ni ipa pataki lori P <0.05 (*).
Fún ìwádìí fluorescence ti Gas1-GFP, a gbin àwọn sẹ́ẹ̀lì log phase ní òru kan nínú YPD a sì kó wọn jọ nípa centrifugation, a fọ̀ wọ́n pẹ̀lú phosphate buffered saline nígbà méjì, a sì fi sínú yìnyín fún ó kéré tán ìṣẹ́jú 15, lẹ́yìn náà a tẹ̀síwájú lábẹ́ microscope gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀. A lo microscope Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 epo PH3 CS) tí a fi lẹ́nsì objective, àlẹ̀mọ́ L5 (GFP), kámẹ́rà Hamamatsu àti sọ́fítíwọ́ọ̀kì Application Suite X (LAS X) fún ríra.
A fi SDS sample buffer ṣe àtúnṣe àwọn àyẹ̀wò náà ní 65°C fún ìṣẹ́jú mẹ́wàá, lẹ́yìn náà a yà wọ́n sọ́tọ̀ pẹ̀lú SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Fún ìwádìí immunoblotting, a gbé 10 μl ti àyẹ̀wò sínú ìlà kọ̀ọ̀kan. Antibody àkọ́kọ́: Lo rabbit polyclonal anti-Gas1 ní ìfàsẹ́yìn 1:3000, rabbit polyclonal anti-Emp24 ní ìfàsẹ́yìn 1:500, àti rabbit polyclonal anti-GFP (ẹ̀bùn láti ọ̀dọ̀ H. Riezman) ní ìfàsẹ́yìn 1:3000. A lo monoclonal anti-Pgk1 antibody eku ní ìfàsẹ́yìn 1:5000 (ẹ̀bùn láti ọ̀dọ̀ J. de la Cruz). Antibody kejì: Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) tí a lò ní ìfàsẹ́yìn 1:3000 (Pierce). A lo IgG ewúrẹ́ tí a so pọ̀ mọ́ HRP ní ìdàpọ̀ 1:3000 (Pierce). A ṣe àkíyèsí agbègbè ìdáhùn ààbò nípa lílo ọ̀nà chemiluminescence ti SuperSignal West Pico reagent (Thermo Fisher Scientific).
Gẹ́gẹ́ bí a ṣe ṣàlàyé rẹ̀ nínú (31), a ṣe ìdánwò ìdènà àrùn àdánidá lórí ìpín ER tí ó ní ọrọ̀. Ní kúkúrú, fọ àwọn sẹ́ẹ̀lì ìwúkàrà pẹ̀lú TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride àti àdàpọ̀ protease inhibitor) ní 600 nm (OD600) ní 100 optical density lẹ́ẹ̀mejì. A fi àwọn ìlẹ̀kẹ̀ gilasi fọ́ ọ, lẹ́yìn náà a yọ àwọn ìdọ̀tí sẹ́ẹ̀lì àti àwọn ìlẹ̀kẹ̀ gilasi kúrò nípa centrifugation. Lẹ́yìn náà, a fi centrifugation sí 17,000 g fún ìṣẹ́jú 15 ní 4°C. A tún fi pellet náà sínú TNE, a sì fi digitalis saponin kún un sí ìpele ìkẹyìn ti 1%. A fi centrifugation sí 14°C, lẹ́yìn náà a yọ àwọn èròjà tí kò lè yọ́ kúrò nípa centrifugation ní 13,000 g ní 4°C fún ìṣẹ́jú 60. Fún ìdènà àrùn Gas1-GFP, kọ́kọ́ fi àwọn ìlẹ̀kẹ̀ agarose tí kò ní òfo (ChromoTek) sínú àyẹ̀wò náà ní 4°C fún wákàtí kan, lẹ́yìn náà fi GFP-Trap_A (ChromoTek) sínú àyẹ̀wò ní 4°C fún wákàtí mẹ́ta. A fọ àwọn ìlẹ̀kẹ̀ tí a ti fi ìdènà àrùn náà ṣe nígbà márùn-ún pẹ̀lú TNE tí ó ní 0.2% digoxigenin, a fi SDS sample buffer wẹ̀ wọ́n, a yà wọ́n sọ́tọ̀ lórí SDS-PAGE, a sì ṣe àyẹ̀wò wọn nípa lílo immunoblotting.
Gẹ́gẹ́ bí a ṣe ṣàlàyé rẹ̀ nínú (31), a ṣe ìpinnu ìsopọ̀pọ̀ lórí ìpín ER tí a ti ṣe àtúnṣe. Ní kúkúrú, a fi 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) sínú ìpín ER tí a ti ṣe àtúnṣe (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min) sínú ìpín ER tí a ti ṣe àtúnṣe. A pa ìṣe ìsopọ̀pọ̀ náà nípa fífi glycine kún un (ìfojúsùn ìkẹyìn 50 mM, ìṣẹ́jú 5, 20°C).
Gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀ (50), a ṣe àyẹ̀wò MS ti ceramide nínú àwọn ẹ̀yà wild-type àti GhLag1. Ní kúkúrú, a gbé àwọn sẹ́ẹ̀lì dàgbà sí ìpele exponential (3 sí 4 OD600 units/ml) nínú YPD ní 30°C, a sì kó àwọn sẹ́ẹ̀lì 25×107 jọ. A pa ìṣiṣẹ́ ara wọn pẹ̀lú trichloroacetic acid. Lo solvent extraction [ethanol, water, ether, pyridine àti 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] àti 1.2 nmol ti inner standard C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) quality). Lo monomethylamine reagent [methanol, water, n-butanol àti methylamine solution (4:3:1:5 v/v)] láti ṣe alkaline hydrolysis díẹ̀ ti extract náà, lẹ́yìn náà lo water-saturated n-butanol láti yọ iyọ̀ kúrò. Níkẹyìn, a tún fi ìyọkúrò náà sínú solvent mode positive [chloroform/methanol/water (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] a sì fi sínú mass spectrometer. A ṣe àyẹ̀wò multi-reaction monitoring (MRM) fún ìdámọ̀ àti ìwọ̀n àwọn molecule sphingolipid. TSQ Vantage tertiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) ní orísun robotic nanoflow ion Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) fún ìwádìí lipid. Agbára ìkọlù náà ni a ṣe àtúnṣe fún ẹ̀ka ceramide kọ̀ọ̀kan. A gba data MS ní ipò rere. Fún àtúnṣe biological kọ̀ọ̀kan, àmì lipid jẹ́ àárín àwọn ìwọ̀n mẹ́ta tí ó dá dúró.
Gẹ́gẹ́ bí a ṣe ṣàlàyé rẹ̀ nínú (31), àwọn sẹ́ẹ̀lì (800×107) tí ó ń ṣàfihàn Gas1-GFP ni a fi agbára ìdènà àrùn àdánidá ṣe. A ya Gas1-GFP tí a ti sọ di mímọ́ sọ́tọ̀ nípa lílo SDS-PAGE, a sì gbé e lọ sí awo polyvinylidene fluoride (PVDF). A fi àmì PVDF ṣe àwọ̀ protein náà. A gé Gas1-GFP láti inú PVDF, a sì fọ̀ ọ́ nígbà márùn-ún pẹ̀lú methanol, a sì fọ̀ ọ́ lẹ́ẹ̀kan pẹ̀lú omi ìpele omi chromatography-MS (LC-MS). Nípa fífi àdàpọ̀ sodium nitrite 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer àti 500μl tí a ti túká ní 1 M sodium nitrite tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ yọ́ ní 37°C fún wákàtí mẹ́ta, a tú ìpín lipid kúrò nínú Gas1-GFP, a sì tú lysed jáde. Ìtújáde inosine phosphate ceramide láàárín glucosamine àti inositol (51). Lẹ́yìn náà, a fi omi LC-MS tó wà nínú àwọ̀ náà fọ ìpele àwọ̀ náà nígbà mẹ́rin, a gbẹ ẹ́ ní iwọ̀n otútù yàrá, a sì tọ́jú rẹ̀ sínú afẹ́fẹ́ nitrogen ní -80°C títí di ìgbà tí a ó fi ṣe àyẹ̀wò rẹ̀. Gẹ́gẹ́ bí ìdarí, a lo àpẹẹrẹ àwọ̀ PVDF tó ṣófo fún ìdánwò kọ̀ọ̀kan. Lẹ́yìn náà ni MS ṣe àyẹ̀wò lipid tí a yọ jáde láti inú Gas1-GFP gẹ́gẹ́ bí a ṣe ṣàlàyé rẹ̀ (50). Ní ​​kúkúrú, a tún fi àwọn ìlà PVDF tí ó ní GPI-lipid sínú 75μl negative mold solvent [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] àti a fi electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Analysis of sphingolipid species (TSQ Vantage). Nínú ọ̀ràn yìí, a gba ìwádìí MS ní ipò ion negative.
Gẹ́gẹ́ bí a ti sọ tẹ́lẹ̀, a ya apá lipid ti anchor GPI kúrò lára ​​[3H]-inositol-labeled GPI-AP (16). A ya àwọn lipids sọ́tọ̀ nípasẹ̀ chromatography tinrin-layer nípa lílo solvent system (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) a sì fi FLA-7000 (Fujifilm) ṣe àfihàn wọn.
A fi TNE buffer fọ àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó ń ṣàfihàn Gas1-GFP (600×107) lẹ́ẹ̀mejì pẹ̀lú TNE buffer, a sì fi àwọn ìlẹ̀kẹ̀ gilasi fọ́, lẹ́yìn náà a fi centrifuge yọ́ àwọn ìdọ̀tí sẹ́ẹ̀lì àti àwọn ìlẹ̀kẹ̀ gilasi kúrò. Lẹ́yìn náà, a fi centrifuge centrifuge sí 17,000 g fún wákàtí kan ní 4°C. A fọ ìlẹ̀kẹ̀ náà nínú TNE a sì fi 1 U PI-PLC (Invitrogen) sínú rẹ̀ nínú TNE tí ó ní 0.2% saponin digitalis fún wákàtí kan ní 37°C. Lẹ́yìn ìtọ́jú enzyme náà, a yọ ìlẹ̀kẹ̀ awọ ara náà kúrò nípa centrifugation ní 17,000 g ní 4°C fún wákàtí kan. Láti mú kí Gas1-GFP má ṣe gbà á láàyè, a fi GFP-Trap_A (ChromoTek) sínú ìlẹ̀kẹ̀ ní 4°C ní alẹ́. A fi Coomassie brilliant blue colorant colorant colorant colorant colorant colorant colorant colorant colorant boarded Gas1-GFP tí a yà sọ́tọ̀ nípasẹ̀ SDS-PAGE. A gé ìdè Gas1-GFP kúrò lára ​​ewé tó yí aqueduct ká, lẹ́yìn náà lẹ́yìn alkylation pẹ̀lú iodoacetamide àti ìdínkù pẹ̀lú dithiothreitol, a ṣe ìjẹun in-gel pẹ̀lú trypsin. A yọ àwọn peptides àti peptides tryptic jáde kí a sì gbẹ wọ́n pẹ̀lú GPI-glycans. A yọ́ peptide gbígbẹ náà sínú omi 20 μl. A fi apá kan (8μl) sínú LC. A lo ọ̀wọ̀n octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; ìwọ̀n inner 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) láti ya àwọn peptides sọ́tọ̀ lábẹ́ àwọn ipò gradient pàtó kan. Ìpele alágbéká ni solvent A (0.08% formic acid) àti solvent B (0.15% formic acid nínú 80% acetonitrile). A lo eto Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) lati yọ ọwọn naa kuro pẹlu solvent A laarin iṣẹju 55 ni oṣuwọn sisan ti 50 μl min-1 fun iṣẹju 5, lẹhinna a mu ifọkansi solvent B pọ si 40%. , Orilẹ Amẹrika). A n gbe eluate naa sinu orisun ion ESI nigbagbogbo, ati pe a ṣe itupalẹ awọn peptides tryptic ati awọn peptides pẹlu GPI-glycans nipasẹ LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific). Ninu eto MS, a ṣeto folti ti orisun capillary si 4.5 kV, ati iwọn otutu ti capillary gbigbe ni a tọju ni 300°C. A ṣeto folti capillary ati folti lẹnsi tube si 15 V ati 50 V, lẹsẹsẹ. A gba data MS ni ipo ion rere (ipinnu 60,000; deedee ibi-itọju ti awọn ẹya 10 fun miliọnu) ni iwọn ibi-itọju ti 300/m/z mass/charge ratio (m/z) 3000. A gba data MS/MS nipasẹ idẹkùn ion ninu LTQ Orbitrap XL [awọn nọmba mẹta akọkọ ti data naa da lori, isọdipọ ti o fa ijamba (CID)].
A ṣe àwọn àgbékalẹ̀ MD nípa lílo sọ́fítíwè GROMACS (52) àti pápá agbára MARTINI 2 (53-55). Lẹ́yìn náà, a lo CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) láti kọ́ bilayer kan tí ó ní dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) àti Cer C18 tàbí DOPC àti Cer C26. Ètò àti ìṣọ̀kan Cer C26 ni a mú láti DXCE nípa yíyọ àwọn ìlẹ̀kẹ̀ afikún kúrò nínú ìrù sphingosine. Lo ìlànà tí a ṣàlàyé ní ìsàlẹ̀ láti ṣe ìwọ̀n ìpele méjì kí o sì ṣiṣẹ́ rẹ̀, lẹ́yìn náà lo ìṣọ̀kan ìkẹyìn ti ètò náà láti kọ́ ètò kan tí ó ní Emp24. A kọ́ agbègbè transmembrane ti ìwúkàrà Emp24 (àwọn àṣẹ́kù 173 sí 193) gẹ́gẹ́ bí α-helix nípa lílo ìrísí molecule irinṣẹ́ visual MD (VMD) (58). Lẹ́yìn náà, lẹ́yìn yíyọ àwọn lipid tí ó wà ní ìkọjá kúrò, a fi èròjà protein náà sínú bilayer náà nípa lílo CHARMM GUI. Ètò ìkẹyìn ní 1202 DOPC àti 302 Cer C26 tàbí 1197 DOPC àti 295 Cer C18 àti Emp24. Ṣe Íónì sí ìṣọ̀kan 0.150M. A ṣe àwọn àtúnṣe mẹ́rin fún àwọn àkójọpọ̀ onípele méjì.
A ṣe ìwọ̀nba lipid bilayer nípa lílo ilana CHARMM GUI, èyí tí ó ní nínú dínkù àti ìwọ́ntúnwọ́nsí àwọn ìgbésẹ̀ 405,000, níbi tí a ti dín àwọn ìdíwọ́ ipò kù díẹ̀díẹ̀ tí a sì ti mú wọn kúrò, àti pé a ti mú ìgbésẹ̀ àkókò pọ̀ sí i láti 0.005 ps sí 0.02 ps. Lẹ́yìn ìwọ́ntúnwọ́nsí, ó ń ṣe 6 µs pẹ̀lú ìgbésẹ̀ àkókò ti 0.02 ps. Lẹ́yìn fífi Emp24 sí i, lo ìlànà CHARMM GUI kan náà láti dínkù àti láti ṣe ìwọ́ntúnwọ́nsí ètò náà, lẹ́yìn náà ṣiṣẹ́ fún 8 s nínú iṣẹ́.
Fún gbogbo ètò, nígbà tí a bá ń ṣe ìwọ́ntúnwọ̀nsí, Berendsen barostat (59) ló ń darí ìfúnpá náà, nígbà tí a bá sì ń ṣe ìṣẹ̀dá náà, Parrinello-Rahman barostat (60) ló ń darí ìfúnpá náà. Ní gbogbo ìgbà, ìwọ̀n ìfúnpá tó wà láàárín jẹ́ 1 bar àti ètò ìsopọ̀ ìfúnpá semi-isotropic ni a ń lò. Nínú ìlànà ìwọ́ntúnwọ̀nsí àti ìṣẹ̀dá, a ń lo thermostat (61) pẹ̀lú ìtúnṣe iyàrá láti so ìwọ̀n ìgbóná ara protein, lipid àti solvent patikulu pọ̀ ní ìpele kọ̀ọ̀kan. Nígbà gbogbo iṣẹ́ náà, ìwọ̀n ìgbóná tí a fẹ́ ṣe ni 310K. A ń ṣírò ìbáṣepọ̀ tí kò ní ìsopọ̀ nípa ṣíṣe àkójọ ìsopọ̀ nípa lílo ètò Verlet pẹ̀lú ìfaradà buffer 0.005. A ń ṣírò ọ̀rọ̀ Coulomb nípa lílo pápá ìṣesí àti ìjìnnà ìgékúrú ti 1.1 nm. Ọ̀rọ̀ Vander Waals lo ètò ìgékúrú pẹ̀lú ìjìnnà ìgékúrú ti 1.1 nm, a sì ń lo ètò ìgékúrú Verlet fún ìyípadà tó ṣeé ṣe (62).
Nípa lílo VMD, a ṣe ìṣirò ìgbìn gígé láàárín àwọn bédì phosphate DOPC tàbí àwọn bédì ceramide AM1 àti àwọn bédì protein náà 0.7 nm, a sì ṣírò iye lipids tí ó ń bá bédì protein náà lò. Gẹ́gẹ́ bí àgbékalẹ̀ tí ó tẹ̀lé e yìí, ṣe ìṣirò ìdínkù-ìdàgbàsókè (DE) factor gẹ́gẹ́ bí ó ti wà nínú (63): DE factor = (iye gbogbo lipids nínú bédì protein 0.7) nínú bédì 0.7 (iye Cer nínú gbogbo lipids)
A gba iye ti a royin gege bi apapọ, ati awọn ọpa aṣiṣe jẹ awọn ẹda mẹrin ti o da lori SE. A ṣe iṣiro pataki iṣiro ti ifosiwewe DE nipasẹ idanwo t [(averageDE-factor-1)/SE]. Ṣe iṣiro iye P lati pinpin onigun kan.
A lo irinṣẹ́ GROMACS láti ṣírò àwòrán ìwọ̀n ẹ̀gbẹ́ 2D ti ètò tí ó ní Emp24 láàárín 250 ns tó kẹ́yìn nínú àmì náà. Láti lè rí àwòrán ìdàgbàsókè/ìparẹ́ ti ceramide, a pín àwòrán ìwọ̀n Cer nípa àpapọ̀ àwòrán Cer àti DOPC, lẹ́yìn náà a pín in sí ìpín Cer nínú ara. A lo ìwọ̀n àwòrán àwọ̀ kan náà.
Fún àwọn ohun èlò afikún fún àpilẹ̀kọ yìí, jọ̀wọ́ wo http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Àpilẹ̀kọ yìí jẹ́ ìwé tí a pín síta lábẹ́ àwọn òfin Creative Commons Attribution-Non-Commerce License, èyí tí ó fún lílo, pínpín àti àtúnṣe ní ọ̀nà èyíkéyìí, níwọ̀n ìgbà tí lílo ìkẹyìn kò bá jẹ́ fún èrè ìṣòwò àti pé àbá náà ni pé iṣẹ́ àtilẹ̀wá náà tọ́. Ìtọ́kasí.
Àkíyèsí: A kàn ń béèrè lọ́wọ́ rẹ láti fún ọ ní àdírẹ́sì ìmeeli rẹ kí ẹni tí o bá dámọ̀ràn sí ojú ìwé náà lè mọ̀ pé o fẹ́ kí wọ́n rí ìmeeli náà àti pé kì í ṣe àwúrúju. A kò ní gba àdírẹ́sì ìmeeli kankan.
A lo ibeere yii lati danwo boya alejo ni o ati lati dena ifisilẹ spam laifọwọyi.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Wape Miss), Argio Wapez (Sergio Wapez), Argio Wakoga (Sergio Wapez). (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Àwòrán 3D tó ní ìpele gíga ní àkókò gidi fi hàn pé ó ṣe pàtàkì kí a lè yan àwọn èròjà protein ní àwọn ibi tí a yàn láti ṣe àtúnṣe.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Wape Miss), Argio Wapez (Sergio Wapez), Argio Wakoga (Sergio Wapez). (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Àwòrán 3D tó ní ìpele gíga ní àkókò gidi fi hàn pé ó ṣe pàtàkì kí a lè yan àwọn èròjà protein ní àwọn ibi tí a yàn láti ṣe àtúnṣe.
©2020 Ẹgbẹ Amẹrika fun Ilọsiwaju ti Imọ. gbogbo awọn ẹtọ wa ni ipamọ. AAAS jẹ alabaṣepọ ti HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ati COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.