A ti royin tẹlẹ pe ipele serum ti tryptophan metabolite indole-3-propionic acid (IPA) ti inu ikun dinku ninu awọn alaisan ti o ni fibrosis ẹdọ. Ninu iwadi yii, a ṣe iwadii transcriptome ati DNA methylome ninu ẹdọ sanra ni ibatan si ipele IPA serum, ati ipa IPA ninu fifa phenotypic inactivation ti hepatic stellate cells (HSCs) ni vitro.
Ìwádìí náà ní àwọn aláìsàn tó sanra 116 tí wọn kò ní àrùn àtọ̀gbẹ irú kejì (T2DM) (ọjọ́ orí wọn jẹ́ 46.8 ± 9.3 ọdún; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) tí wọ́n ṣe iṣẹ́ abẹ bariatric ní Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS). A wọn ipele IPA nípa lílo liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), a ṣe àyẹ̀wò ẹ̀dọ̀ nípa lílo total RNA sequencing, a sì ṣe àyẹ̀wò methylation DNA nípa lílo Infinium HumanMethylation450 BeadChip. A lo àwọn sẹ́ẹ̀lì hepatic stellate ènìyàn (LX-2) fún àwọn àyẹ̀wò in vitro.
Ipele IPA ninu omi ara ni asopọ pẹlu ifihan awọn jiini ti o ni ipa ninu awọn ipa ọna apoptotic, mitophagic, ati gigun ninu ẹdọ. Jiini AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) ni jiini ti o pọ julọ ati ti o ni ipa lori iṣipopada ẹdọ ati awọn profaili methylation DNA. Itọju IPA fa apoptosis, idinku mimi mitochondrial, ati iyipada morphology sẹẹli ati awọn agbara mitochondrial nipa ṣiṣe atunṣe ikosile awọn jiini ti a mọ lati ṣakoso fibrosis, apoptosis, ati iwalaaye awọn sẹẹli LX-2.
Ní àpapọ̀, àwọn ìwádìí wọ̀nyí ń fi hàn pé IPA ní àwọn ipa ìtọ́jú tó ṣeéṣe, ó sì lè fa apoptosis, kí ó sì yí irú HSC padà sí ipò aláìṣiṣẹ́, nípa bẹ́ẹ̀ ó ń mú kí ó ṣeéṣe láti dènà fibrosis ẹ̀dọ̀ nípa dídínà ìṣiṣẹ́ HSC àti ìṣiṣẹ́ mitochondrial.
Ìbísí ìsanra àti àìsàn ìṣàn ara ti ní í ṣe pẹ̀lú ìbísí àrùn ẹ̀dọ̀ tí ó níí ṣe pẹ̀lú ìṣiṣẹ́ ara (MASLD); àrùn náà ń ní ipa lórí 25% sí 30% gbogbo ènìyàn [1]. Àbájáde pàtàkì ti ìdí MASLD ni fibrosis ẹ̀dọ̀, ìlànà ìṣiṣẹ́ tí a fi ń ṣe àfihàn ìkójọpọ̀ fibrous extracellular matrix (ECM) nígbà gbogbo [2]. Àwọn sẹ́ẹ̀lì pàtàkì tí ó níí ṣe pẹ̀lú fibrosis ẹ̀dọ̀ ni àwọn sẹ́ẹ̀lì hepatic stellate (HSCs), tí ó ń fi àwọn ànímọ́ mẹ́rin tí a mọ̀ hàn: quiescent, activated, inactivated, àti senescent [3, 4]. A lè mu àwọn HSC ṣiṣẹ́ kí a sì yí wọn padà láti inú ìrísí quiescent sí àwọn sẹ́ẹ̀lì bíi fibroblast tí ó ń pọ̀ sí i pẹ̀lú àwọn ìbéèrè agbára gíga, pẹ̀lú ìfarahàn α-smooth muscle actin (α-SMA) àti type I collagen (Col-I) tí ó pọ̀ sí i [5, 6]. Nígbà ìyípadà fibrosis ẹ̀dọ̀, a máa ń mú àwọn HSC tí a mú ṣiṣẹ́ kúrò nípasẹ̀ apoptosis tàbí inactivation. Àwọn ìlànà wọ̀nyí ní ìdènà àwọn jínì fibrogenic àti ìyípadà àwọn jínì prosurvival (bíi NF-κB àti PI3K/Akt signal pathways) [7, 8], àti àwọn ìyípadà nínú mitochondrial dynamics àti function [9].
A ti rii pe ipele omi ara ti tryptophan metabolite indole-3-propionic acid (IPA), ti a n se ninu ifun, dinku ninu awọn aisan ti o ni ipa lori ara eniyan pẹlu MASLD [10-13]. IPA ni nkan ṣe pẹlu jijẹ okun onjẹ, a mọ ọ fun awọn ipa antioxidant ati egboogi-iredodo rẹ, o si dinku irisi steatohepatitis ti kii ṣe ọti-lile (NASH) ti ounjẹ fa ni vivo ati in vitro [11-14]. Diẹ ninu awọn ẹri wa lati inu iwadi wa ti tẹlẹ, eyiti o fihan pe awọn ipele IPA serum kere si ninu awọn alaisan ti o ni fibrosis ẹdọ ju awọn alaisan ti o sanra laisi fibrosis ẹdọ lọ ninu Iwadi Iṣẹ-abẹ Kuopio Bariatric (KOBS). Pẹlupẹlu, a fihan pe itọju IPA le dinku ifihan awọn jiini ti o jẹ awọn ami kilasika ti adhesion sẹẹli, gbigbe sẹẹli ati imuṣiṣẹ sẹẹli hematopoietic ninu awoṣe sẹẹli hepatic stellate eniyan (LX-2) ati pe o jẹ metabolite aabo hepatoprotective ti o ṣeeṣe [15]. Sibẹsibẹ, ko ṣiyemeji bi IPA ṣe n fa regression fibrosis ẹdọ nipa ṣiṣiṣẹ apoptosis HSC ati awọn bioenergetics mitochondrial.
Níbí, a fihàn pé IPA serum ní í ṣe pẹ̀lú ìfarahàn àwọn jínì tí a fi kún apoptosis, mitophagy, àti àwọn ipa ọ̀nà gígùn nínú ẹ̀dọ̀ àwọn ènìyàn tí wọ́n ní àtọ̀gbẹ onípele méjì ṣùgbọ́n tí kì í ṣe irú àtọ̀gbẹ (KOBS). Jù bẹ́ẹ̀ lọ, a rí i pé IPA lè fa ìparẹ́ àti ìbàjẹ́ àwọn sẹ́ẹ̀lì ìpìlẹ̀ hematopoietic (HSCs) nípasẹ̀ ipa ọ̀nà àìṣiṣẹ́. Àwọn èsì wọ̀nyí fi ipa tuntun hàn fún IPA, èyí tí ó sọ ọ́ di ibi tí a lè fojú sí láti ṣe àgbékalẹ̀ ìfàsẹ́yìn fibrosis ẹ̀dọ̀.
Ìwádìí kan tí a ṣe tẹ́lẹ̀ nínú ẹgbẹ́ KOBS fihàn pé àwọn aláìsàn tí wọ́n ní àrùn fibrosis ẹ̀dọ̀ ní ìwọ̀n IPA tí ó lọ sílẹ̀ ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn aláìsàn tí kò ní àrùn fibrosis ẹ̀dọ̀ [15]. Láti yọ ipa tí ó lè fa ìdàrúdàpọ̀ àrùn àtọ̀gbẹ irú kejì kúrò, a yan àwọn aláìsàn tí wọ́n sanra 116 tí kò ní àrùn àtọ̀gbẹ irú kejì (ọjọ́ orí tí ó dọ́gba ± SD: 46.8 ± 9.3 ọdún; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Táblì 1) láti inú ìwádìí KOBS tí ń lọ lọ́wọ́ gẹ́gẹ́ bí iye àwọn ènìyàn tí wọ́n ń ṣe ìwádìí náà [16]. Gbogbo àwọn olùkópa fúnni ní àṣẹ ìkọ̀wé tí a kọ sílẹ̀, Ìgbìmọ̀ Ìwà rere ti Ilé Ìwòsàn North Savo County sì fọwọ́ sí ìlànà ìwádìí náà ní ìbámu pẹ̀lú Ìkéde Helsinki (54/2005, 104/2008 àti 27/2010).
A gba awọn ayẹwo biopsy ẹ̀dọ̀ nígbà iṣẹ́-abẹ bariatric, àwọn onímọ̀ nípa àrùn sì ṣe àyẹ̀wò wọn pẹ̀lú histological gẹ́gẹ́ bí àwọn ìlànà tí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀ [17, 18]. Àwọn ìlànà ìṣàyẹ̀wò ni a ṣe àkópọ̀ nínú Àtẹ Àfikún S1, a sì ti ṣàlàyé wọn tẹ́lẹ̀ [19].
A ṣe àyẹ̀wò àwọn àpẹẹrẹ ẹ̀jẹ̀ ààwẹ̀ nípa lílo ìṣàyẹ̀wò omi tí a kò fojú sí (LC-MS) fún ìṣàyẹ̀wò metabolomics (n = 116). A ṣe àyẹ̀wò àwọn àpẹẹrẹ nípa lílo ètò UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀19. Ìdámọ̀ ọtí isopropyl (IPA) da lórí àkókò ìpamọ́ àti ìfiwéra MS/MS pẹ̀lú àwọn ìlànà mímọ́. A gbé agbára àmì IPA (agbègbè gíga) yẹ̀ wò nínú gbogbo àwọn ìṣàyẹ̀wò síwájú síi [20].
A ṣe ìtẹ̀lé RNA gbogbo ẹ̀dọ̀ nípa lílo Illumina HiSeq 2500, a sì ti ṣe ìtọ́jú data tẹ́lẹ̀ gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ tẹ́lẹ̀ [19, 21, 22]. A ṣe ìwádìí ìyàtọ̀ ìfọ̀rọ̀wérọ̀ tí a fojúsùn sí ti àwọn àkọsílẹ̀ tí ó ní ipa lórí iṣẹ́/biogenesis mitochondrial nípa lílo àwọn jínì 1957 tí a yàn láti inú ibi ìpamọ́ MitoMiner 4.0 [23]. A ṣe ìwádìí methylation DNA ẹ̀dọ̀ nípa lílo Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) nípa lílo ọ̀nà kan náà gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ tẹ́lẹ̀ [24, 25].
Ọ̀jọ̀gbọ́n Stefano Romeo fi inú rere pèsè àwọn sẹ́ẹ̀lì ìgbẹ́ ẹ̀jẹ̀ ènìyàn (LX-2) wọ́n sì tọ́jú wọn nínú DMEM/F12 medium (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Láti yan ìwọ̀n iṣẹ́ IPA, a tọ́jú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 pẹ̀lú onírúurú ìwọ̀n IPA (10 μM, 100 μM àti 1 mM; Sigma, 220027) nínú DMEM/F12 medium fún wákàtí 24. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, láti ṣe ìwádìí nípa agbára IPA láti dá HSCs dúró, a fi 5 ng/ml TGF-β1 (àwọn ètò R&D, 240-B-002/CF) àti 1 mM IPA nínú cellular tí kò ní serum tọ́jú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 fún wákàtí 24. Fún àwọn ìṣàkóso ọkọ̀ tó báramu, a lo 4 nM HCL tó ní 0.1% BSA fún ìtọ́jú TGF-β1 àti 0.05% DMSO fún ìtọ́jú IPA, a sì lo àwọn méjèèjì papọ̀ fún ìtọ́jú àpapọ̀.
A ṣe àyẹ̀wò Apoptosis nípa lílo FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit pẹ̀lú 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè. Ní ṣókí, a gbin LX-2 (1 × 105 sẹ́ẹ̀lì/kòtò) ní alẹ́ kan nínú àwọn àwo 12, lẹ́yìn náà a fi ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìwọ̀n IPA tàbí IPA àti TGF-β1 tọ́jú wọn. Ní ọjọ́ kejì, a kó àwọn sẹ́ẹ̀lì tó ń léfòó àti tó ń so mọ́ ara wọn jọ, a fi trypsin wẹ̀ wọ́n, a fi PBS wẹ̀ wọ́n, a tún fi Annexin V binding buffer dì í mú, a sì fi FITC-Annexin V àti 7-AAD dì í fún ìṣẹ́jú 15.
A fi àwọ̀ sí Mitochondria nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì alààyè nípa lílo Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Fún àwọn àyẹ̀wò MTR, a fi àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 sínú ihò pẹ̀lú IPA àti TGF-β1. Lẹ́yìn wákàtí 24, a fi trypsin wẹ̀ àwọn sẹ́ẹ̀lì alààyè, a fi PBS wẹ̀ wọ́n, lẹ́yìn náà a fi 100 μM MTR sínú ihò tí kò ní serum ní 37 °C fún ìṣẹ́jú 20 gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀ [26]. Fún àyẹ̀wò morphology sẹ́ẹ̀lì alààyè, a ṣe àyẹ̀wò ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì àti ìṣòro cytoplasmic nípa lílo àwọn paramita forward scatter (FSC) àti side scatter (SSC), lẹ́sẹẹsẹ.
Gbogbo data (iṣẹlẹ 30,000) ni a gba nipa lilo NovoCyte Quanteon (Agilent) ati pe a ṣe itupalẹ wọn nipa lilo sọfitiwia NovoExpress® 1.4.1 tabi FlowJo V.10.
A wọn oṣuwọn lilo atẹgun (OCR) ati oṣuwọn acidification extracellular (ECAR) ni akoko gidi nipa lilo Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ti a fi Seahorse XF Cell Mito Stress ṣe gẹgẹ bi awọn ilana olupese. Ni ṣoki, a gbìn awọn sẹẹli 2 × 104 LX-2/kanga sori awọn awo asa sẹẹli XF96. Lẹhin isunmọ alẹ, a tọju awọn sẹẹli pẹlu isopropanol (IPA) ati TGF-β1 (Awọn ọna Afikun 1). A ṣe itupalẹ data nipa lilo sọfitiwia Seahorse XF Wave, eyiti o pẹlu Generator Iroyin Idanwo Ẹmi Seahorse XF Cell. Lati inu eyi, a ṣe iṣiro Atọka Ilera Bioenergetic (BHI) [27].
A kọ gbogbo RNA sinu cDNA. Fun awọn ọna kan pato, wo itọkasi [15]. A lo awọn ipele mRNA ti eniyan 60S ribosomal acidic P0 (RPLP0) ati cyclophilin A1 (PPIA) gẹgẹbi awọn iṣakoso jiini constitutive. A lo QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, The Netherlands) pẹlu TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) tabi Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), ati pe a ṣe iṣiro fold ikosile jiini relatial nipa lilo awọn paramita iyipo iye Ct afiwera (ΔΔCt) ati ọna ∆∆Ct. Awọn alaye ti awọn alakoko ni a pese ninu Awọn Tabili Afikun S2 ati S3.
A fa DNA iparun (ncDNA) ati DNA mitochondrial (mtDNA) jade nipa lilo ohun elo ẹjẹ ati àsopọ DNeasy (Qiagen) gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ [28]. A ṣe iṣiro iye ibatan ti mtDNA nipa ṣiṣe iṣiro ipin ti agbegbe mtDNA afojusun kọọkan si apapọ jiometiriki ti awọn agbegbe DNA iparun mẹta (mtDNA/ncDNA), gẹgẹ bi a ti ṣe alaye rẹ ninu Awọn ọna Afikun 2. Awọn alaye ti awọn alakoko fun mtDNA ati ncDNA ni a pese ninu Tabili Afikun S4.
A fi àwọ̀ Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) kun awọn sẹẹli laaye lati wo awọn nẹtiwọọki mitochondrial intercellular ati inu ara. A gbin awọn sẹẹli LX-2 (awọn sẹẹli 1 × 104/kanga) lori awọn ifaworanhan gilasi ni awọn awo asa ti a fi gilasi bo (Ibidi GmbH, Martinsried, Germany). Lẹhin wakati 24, a fi 100 μM MTR sinu awọn sẹẹli LX-2 laaye fun iṣẹju 20 ni iwọn otutu 37 °C ati a fi DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) kun awọn nucleus sẹẹli gẹgẹ bi a ti ṣalaye tẹlẹ [29]. A fi aworan awọn nẹtiwọọki Mitochondrial han nipa lilo microscope Zeiss Axio Observer ti a yipada (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) ti a pese pẹlu modulu confocal Zeiss LSM 800 ni 37 °C ni afẹfẹ ti o tutu pẹlu 5% CO2 nipa lilo ohun elo 63 × NA 1.3. A gba awọn aworan Z-series mẹwa fun iru ayẹwo kọọkan. Ìsọ̀rí Z kọ̀ọ̀kan ní àwọn apá 30, ọ̀kọ̀ọ̀kan pẹ̀lú ìfúnpọ̀ 9.86 μm. Fún àpẹẹrẹ kọ̀ọ̀kan, a gba àwòrán àwọn pápá ìwòran mẹ́wàá ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ nípa lílo sọ́fítíwè ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany), a sì ṣe ìwádìí nípa morphology mitochondrial nípa lílo sọ́fítíwè ImageJ (v1.54d) [30, 31] gẹ́gẹ́ bí àwọn pàrámítà tí a ṣàlàyé nínú Àwọn Ọ̀nà Àfikún 3.
A fi glutaraldehyde 2% so àwọn sẹ́ẹ̀lì náà pọ̀ mọ́ 0.1 M phosphate buffer, lẹ́yìn náà a fi omi osmium tetroxide 1% (Sigma Aldrich, MO, USA), a fi acetone (Merck, Darmstadt, Germany) gbẹ díẹ̀díẹ̀, a sì fi epoxy resini sí i nígbẹ̀yìn gbẹ́yín. A pèsè àwọn apá tó tinrin gan-an, a sì fi 1% uranyl acetate (Merck, Darmstadt, Germany) àti 1% lead citrate (Merck, Darmstadt, Germany) kun àwọn àwòrán Ultrastructural. A gba àwọn àwòrán Ultrastructural nípa lílo JEM 2100F EXII transmission electron microscope (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) ní voltage iyara ti 80 kV.
A ṣe àyẹ̀wò ìrísí àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 tí a fi IPA tọ́jú fún wákàtí mẹ́rìnlélógún nípa lílo microscopy ìyàtọ̀-àkókò ní ìgbéga 50x nípa lílo microscope ìmọ́lẹ̀ tí a yí padà sí Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 àti AxioCam MRm, Jena, Germany).
A ṣe àfihàn àwọn ìwádìí ìṣègùn gẹ́gẹ́ bí ìdajì ± ìyípadà standard tàbí median (interquartile range: IQR). A lo ìwádìí ìyàtọ̀ ọ̀nà kan (continuous variables) tàbí ìdánwò χ² (categorical variables) láti fi wé àwọn ìyàtọ̀ láàrín àwọn ẹgbẹ́ ìwádìí mẹ́ta náà. A lo ìwọ̀n rere èké (FDR) láti ṣe àtúnṣe fún ọ̀pọ̀ ìdánwò, àti àwọn jínì pẹ̀lú FDR < 0.05 ni a kà sí pàtàkì ní ìṣirò. A lo ìwádìí ìbáṣepọ̀ Spearman láti so CpG DNA methylation pọ̀ mọ́ agbára ìṣàfihàn IPA, pẹ̀lú àwọn iye p nominal (p < 0.05) tí a ròyìn.
A ṣe àgbéyẹ̀wò ipa ọ̀nà nípa lílo ohun èlò ìwádìí jínì tí a fi ojú-òpó wẹ́ẹ̀bù ṣe (WebGestalt) fún àwọn àkọsílẹ̀ 268 (p < 0.01), àwọn àkọsílẹ̀ tí a so mọ́ mitochondria 119 (p < 0.05), àti 4350 CpGs láti inú àwọn àkọsílẹ̀ ẹ̀dọ̀ 3093 tí ó ní í ṣe pẹ̀lú àwọn ìpele IPA tí ń tàn káàkiri nínú ẹ̀jẹ̀. A lo ohun èlò Venny DB (ẹ̀yà 2.1.0) tí ó wà lọ́fẹ̀ẹ́ láti wá àwọn jínì tí ó ń wọ́pọ̀, a sì lo StringDB (ẹ̀yà 11.5) láti fojú inú wo ìbáṣepọ̀ amuaradagba àti amuaradagba.
Fún ìdánwò LX-2, a dán àwọn àpẹẹrẹ wò fún ìdàgbàsókè nípa lílo ìdánwò D'Agostino-Pearson. A gba àwọn dátà láti inú àwọn àtúnṣe ẹ̀dá mẹ́ta ó kéré tán, a sì fi wọ́n sí ANOVA ọ̀nà kan pẹ̀lú ìdánwò Bonferroni lẹ́yìn hoc. A kà iye p tí kò tó 0.05 sí pàtàkì ní ìṣirò. A gbé àwọn dátà kalẹ̀ gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n ± SD, a sì fi iye àwọn ìdánwò hàn nínú àwòrán kọ̀ọ̀kan. A ṣe gbogbo àwọn àyẹ̀wò àti àwọn àwòrán nípa lílo software statistiki GraphPad Prism 8 fún Windows (GraphPad Software Inc., ẹ̀yà 8.4.3, San Diego, USA).
Àkọ́kọ́, a ṣe ìwádìí nípa ìbáṣepọ̀ àwọn ìpele IPA nínú ẹ̀jẹ̀ pẹ̀lú ẹ̀dọ̀, gbogbo ara, àti àwọn àkọsílẹ̀ mitochondrial. Nínú àpapọ̀ àkọsílẹ̀ transcription, jínì tó lágbára jùlọ tí ó níí ṣe pẹ̀lú ìpele IPA nínú ẹ̀jẹ̀ ni MAPKPK3 (FDR = 0.0077; protein kinase-activated mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3); nínú àkọsílẹ̀ transcription tí ó níí ṣe pẹ̀lú mitochondria, jínì tó lágbára jùlọ tí ó níí ṣe pẹ̀lú rẹ̀ ni AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Fáìlì afikún 1 àti fáìlì afikún 2).
Lẹ́yìn náà, a ṣe àyẹ̀wò àwọn àkọsílẹ̀ àgbáyé (n = 268; p < 0.01) àti àwọn àkọsílẹ̀ tí ó níí ṣe pẹ̀lú mitochondria (n = 119; p < 0.05), ní ìparí a ti dá apoptosis mọ̀ gẹ́gẹ́ bí ipa ọ̀nà ìṣàpẹẹrẹ tó ṣe pàtàkì jùlọ (p = 0.0089). Fún àwọn àkọsílẹ̀ mitochondrial tí ó níí ṣe pẹ̀lú àwọn ìpele IPA nínú serum, a dojúkọ apoptosis (FDR = 0.00001), mitophagy (FDR = 0.00029), àti àwọn ipa ọ̀nà ìfàmọ́ra TNF (FDR = 0.000006) (Àwòrán 1A, Táblì 2, àti Àwọn Àfikún Àwọn Àwòrán 1A-B).
Àgbéyẹ̀wò tó wọ́pọ̀ lórí àgbáyé, àwọn àkọsílẹ̀ tó níí ṣe pẹ̀lú mitochondria, àti methylation DNA nínú ẹ̀dọ̀ ènìyàn ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú àwọn ìpele IPA nínú ẹ̀jẹ̀. A dúró fún àwọn àkọsílẹ̀ àgbáyé 268, àwọn àkọsílẹ̀ tó níí ṣe pẹ̀lú mitochondria 119, àti àwọn àkọsílẹ̀ methylated DNA tí a yà sọ́tọ̀ sí àwọn ibi CpG 3092 tí ó níí ṣe pẹ̀lú àwọn ìpele IPA nínú ẹ̀jẹ̀ (àwọn ìwọ̀n p < 0.01 fún àwọn àkọsílẹ̀ àgbáyé àti DNA methylated, àti àwọn ìwọ̀n p < 0.05 fún àwọn àkọsílẹ̀ mitochondrial). Àwọn àkọsílẹ̀ tó wọ́pọ̀ jùlọ ni a fihàn ní àárín (AKT1 àti YKT6). B. Máàpù ìbáṣepọ̀ àwọn jínì 13 tí ó ní àmì ìbáṣepọ̀ tó ga jùlọ (0.900) pẹ̀lú àwọn jínì mìíràn ni a kọ́ láti inú àwọn jínì 56 tí ó wọ́pọ̀ (agbègbè ìlà dúdú) tí wọ́n níí ṣe pẹ̀lú àwọn ìpele IPA nínú ẹ̀jẹ̀ nípa lílo irinṣẹ́ orí ayélujára StringDB. Àwọ̀ ewé: Àwọn jínì tí a yà sọ́tọ̀ sí ẹ̀yà sẹ́ẹ̀lì Gene Ontology (GO): mitochondria (GO:0005739). AKT1 ni amuaradagba ti o ni ami ti o ga julọ (0.900) fun ibaraenisepo pẹlu awọn ọlọjẹ miiran ti o da lori data (ti o da lori iwakusa ọrọ, awọn idanwo, awọn ibi ipamọ data, ati ikosile ajọṣepọ). Awọn nodes nẹtiwọọki duro fun awọn ọlọjẹ, ati awọn eti duro fun awọn asopọ laarin awọn ọlọjẹ.
Níwọ́n ìgbà tí àwọn metabolites microbiota inú ikùn lè ṣàkóso ìṣẹ̀dá epigenetic nípasẹ̀ DNA methylation [32], a ṣe ìwádìí bóyá ìpele IPA nínú serum ní í ṣe pẹ̀lú methylation DNA ẹ̀dọ̀. A rí i pé àwọn ibi methylation pàtàkì méjì tí ó ní í ṣe pẹ̀lú ìpele IPA nínú serum wà nítòsí agbègbè proline-serine-rich 3 (C19orf55) àti ìdílé protein shock heat 6 (HSPB6) (Fáìlì afikún 3). Methylation DNA ti 4350 CpG (p < 0.01) ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú ìpele IPA nínú serum ó sì ní ìdàgbàsókè nínú àwọn ipa ọ̀nà ìṣàkóso gígùn (p = 0.006) (Àwòrán 1A, Táblì 2, àti Àwòrán Afikun 1C).
Láti lóye àwọn ìlànà ìṣẹ̀dá tí ó wà lábẹ́ ìsopọ̀ láàárín àwọn ìpele IPA nínú ẹ̀jẹ̀, àwọn àkọsílẹ̀ àgbáyé, àwọn àkọsílẹ̀ tí ó ní í ṣe pẹ̀lú mitochondria, àti methylation DNA nínú ẹ̀dọ̀ ènìyàn, a ṣe ìṣàyẹ̀wò ìdàpọ̀ ti àwọn jínì tí a ṣàwárí nínú ìṣàyẹ̀wò ipa ọ̀nà tí ó ṣáájú (Àwòrán 1A). Àwọn àbájáde ìṣàyẹ̀wò ìdàgbàsókè ipa ọ̀nà ti àwọn jínì 56 tí ó jọra (nínú ìlà dúdú nínú Àwòrán 1A) fihàn pé ipa ọ̀nà apoptosis (p = 0.00029) ṣe àfihàn àwọn jínì méjì tí ó wọ́pọ̀ sí àwọn ìṣàyẹ̀wò mẹ́ta náà: AKT1 àti YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog), gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn nínú àwòrán Venn (Àwòrán Àfikún 2 àti Àwòrán 1A). Lọ́nà tí ó dùn mọ́ni, a rí i pé AKT1 (cg19831386) àti YKT6 (cg24161647) ní ìbáṣepọ̀ rere pẹ̀lú àwọn ìpele IPA nínú ẹ̀jẹ̀ (Fáìlì Àfikún 3). Láti dá àwọn ìbáṣepọ̀ amuaradagba tí ó ṣeé ṣe láàárín àwọn ọjà jínì mọ̀, a yan àwọn jínì 13 tí wọ́n ní àmì agbègbè tí ó wọ́pọ̀ jùlọ (0.900) láàrín àwọn jínì 56 tí ó jọra gẹ́gẹ́ bí ìtẹ̀síwájú a sì kọ́ àwòrán ìbáṣepọ̀ kan. Gẹ́gẹ́ bí ìpele ìgbẹ́kẹ̀lé (ìgbẹ́kẹ̀lé ààlà), jínì AKT1 tí ó ní àmì tó ga jùlọ (0.900) ló wà ní òkè (Àwòrán 1B).
Ní ìbámu pẹ̀lú ìṣàyẹ̀wò ipa ọ̀nà, a rí i pé apoptosis ni ipa ọ̀nà pàtàkì, nítorí náà a ṣe ìwádìí bóyá ìtọ́jú IPA yóò ní ipa lórí apoptosis ti HSCs in vitro. A ti fihàn tẹ́lẹ̀ pé àwọn ìwọ̀n IPA tó yàtọ̀ síra (10 μM, 100 μM, àti 1 mM) kò léwu sí àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 [15]. Ìwádìí yìí fihàn pé ìtọ́jú IPA ní 10 μM àti 100 μM mú iye àwọn sẹ́ẹ̀lì tó ṣeé gbéṣe àti necrotic pọ̀ sí i. Síbẹ̀síbẹ̀, ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso, agbára sẹ́ẹ̀lì dínkù ní ìṣọ̀kan IPA 1 mM, nígbà tí ìwọ̀n necrosis sẹ́ẹ̀lì kò yí padà (Àwòrán 2A, B). Lẹ́yìn náà, láti rí ìṣọ̀kan tó dára jùlọ láti fa apoptosis nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2, a dán 10 μM, 100 μM, àti 1 mM IPA wò fún wákàtí 24 (Àwòrán 2A-E àti Àwòrán Àfikún 3A-B). Lọ́nà tó yani lẹ́nu, IPA 10 μM àti 100 μM dín ìwọ̀n apoptosis kù (%), síbẹ̀síbẹ̀, IPA 1 mM mú kí ìwọ̀n apoptosis àti apoptosis tó pẹ́ (%) pọ̀ sí i ní ìfiwéra pẹ̀lú ìṣàkóso, nítorí náà, a yàn án fún àwọn àyẹ̀wò síwájú sí i (Àwòrán 2A–D).
IPA ń fa apoptosis ti awọn sẹẹli LX-2. A lo ọna Annexin V ati 7-AAD double staining lati ṣe iṣiro oṣuwọn apoptotic ati morphology sẹẹli nipasẹ cytometry flow. A fi 10 μM, 100 μM ati 1 mM IPA sinu awọn sẹẹli BA fun wakati 24 tabi pẹlu F–H TGF-β1 (5 ng/ml) ati 1 mM IPA ninu alabọde ti ko ni serum fun wakati 24. A: awọn sẹẹli alãye (Annexin V -/ 7AAD-); B: awọn sẹẹli necrotic (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: kutukutu (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: pẹ (Annexin V+/7AAD.+); E, H: ogorun gbogbo awọn sẹẹli apoptotic tete ati pẹ ni oṣuwọn apoptotic (%). A ṣe afihan data gẹgẹbi apapọ ± SD, n = awọn idanwo ominira 3. A ṣe àwọn àfiwé ìṣirò nípa lílo ANOVA ọ̀nà kan pẹ̀lú ìdánwò Bonferroni lẹ́yìn hoc. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Gẹ́gẹ́ bí a ti fihàn tẹ́lẹ̀, TGF-β1 5 ng/ml le fa ìṣiṣẹ́ HSC nípa mímú kí ìfarahàn àwọn jínì àmì ìṣáájú pọ̀ sí i [15]. A fi 5 ng/ml TGF-β1 àti 1 mM IPA tọ́jú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 ní àpapọ̀ (Àwòrán 2E–H). Ìtọ́jú TGF-β1 kò yí ìwọ̀n apoptosis padà, síbẹ̀síbẹ̀, ìtọ́jú IPA pọ̀ sí i ní ìparí apoptosis àti ìwọ̀n apoptosis (%) ní ìfiwéra pẹ̀lú ìtọ́jú TGF-β1 (Àwòrán 2E–H). Àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé 1 mM IPA le ṣe ìgbéga apoptosis nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 láìsí ìfàsẹ́yìn TGF-β1.
A tún ṣe ìwádìí lórí ipa IPA lórí ìmísí mitochondrial nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2. Àwọn èsì náà fihàn pé 1 mM IPA dín ìwọ̀n ìlò atẹ́gùn kù (OCR): ìmísí tí kì í ṣe mitochondrial, ìmísí basal àti maximal, ìfúnpọ̀ proton àti ìṣẹ̀dá ATP ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso (Àwòrán 3A, B), nígbà tí àkójọ ìlera bioenergetic (BHI) kò yípadà.
IPA dín ìmísí mitochondrial kù nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2. A gbé ìtẹ̀sí mimí mitochondrial (OCR) kalẹ̀ gẹ́gẹ́ bí àwọn pàrámí mimítochondria (ìmísí mimitochondria tí kìí ṣe mitochondrial, ìmísí basal, ìmísí tó ga jùlọ, ìjìnlẹ̀ proton, ìṣẹ̀dá ATP, SRC àti BHI). A fi 10 μM, 100 μM àti 1 mM IPA sínú àwọn sẹ́ẹ̀lì A àti B fún wákàtí 24, lẹ́sẹẹsẹ. A fi TGF-β1 (5 ng/ml) àti 1 mM IPA sínú àwọn sẹ́ẹ̀lì C àti D nínú ibi tí kò ní serum fún wákàtí 24, lẹ́sẹẹsẹ. Gbogbo ìwọ̀n ni a ṣe déédé sí akoonu DNA nípa lílo CyQuant kit. BHI: bioenergetic health index; SRC: respiratory reserve capacity; OCR: oxygen consumption rate. A gbé àwọn dátà kalẹ̀ gẹ́gẹ́ bí mean ± standard deviation (SD), n = 5 ominira àwọn àdánwò. A ṣe àwọn àfiwé statistiki nípa lílo ìdánwò ANOVA àti Bonferroni-ọ̀nà kan-ọ̀nà. *p < 0.05; **p < 0.01; àti ***p < 0.001
Láti ní òye tó jinlẹ̀ nípa ipa IPA lórí ìrísí bioenergetic ti àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 tí a ti mú ṣiṣẹ́ TGF-β1, a ṣe àyẹ̀wò mitochondrial oxidative phosphorylation nípasẹ̀ OCR (Àwòrán 3C,D). Àwọn àbájáde náà fihàn pé ìtọ́jú TGF-β1 lè dín ìmísí tó pọ̀ jùlọ, agbára ìpamọ́ èémí (SRC) àti BHI kù ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso (Àwòrán 3C,D). Ní ​​àfikún, ìtọ́jú àpapọ̀ dín ìmísí basal, ìtújáde proton àti ìṣẹ̀dá ATP kù, ṣùgbọ́n SRC àti BHI ga ju àwọn tí a fi TGF-β1 tọ́jú lọ (Àwòrán 3C,D).
A tún ṣe “Ìdánwò Ẹ̀rọ Agbára Sẹ́ẹ̀lì” tí sọ́fítíwọ́ọ̀fù Seahorse pèsè (Àfikún Àwòrán 4A–D). Gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn nínú Àfikún Àwòrán 3B, agbára ìṣiṣẹ́ OCR àti ECAR dínkù lẹ́yìn ìtọ́jú TGF-β1, síbẹ̀síbẹ̀, a kò rí ìyàtọ̀ kankan nínú àpapọ̀ àti àwọn ẹgbẹ́ ìtọ́jú IPA ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóṣo. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, àwọn ipele basal àti wahala ti OCR dínkù lẹ́yìn ìṣọ̀kan àti ìtọ́jú IPA ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóṣo (Àfikún Àwòrán 4C). Lọ́nà tí ó yani lẹ́nu, a ṣe àkíyèsí irú àpẹẹrẹ kan náà pẹ̀lú ìtọ́jú àpapọ̀, níbi tí a kò ti rí ìyípadà nínú àwọn ipele basal àti wahala ti ECAR ní ìfiwéra pẹ̀lú ìtọ́jú TGF-β1 (Àfikún Àwòrán 4C). Nínú HSCs, ìdínkù nínú mitochondrial oxidative phosphorylation àti agbára ìtọ́jú àpapọ̀ láti mú SCR àti BHI padà lẹ́yìn ìfarahàn sí ìtọ́jú TGF-β1 kò yí agbára ìṣiṣẹ́ padà (OCR àti ECAR). Ní àpapọ̀, àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé IPA lè dín agbára ìṣiṣẹ́ ara kù nínú àwọn HSC, èyí tí ó fihàn pé IPA lè fa agbára ìṣiṣẹ́ díẹ̀ tí ó ń yí ìrísí HSC padà sí àìṣiṣẹ́ (Àfikún Àwòrán 4D).
A ṣe ìwádìí ipa IPA lórí agbára mitochondrial nípa lílo ìwọ̀n onípele mẹ́ta ti ìrísí mitochondrial àti àwọn ìsopọ̀ nẹ́tíwọ́ọ̀kì àti MTR coloring (Àwòrán 4 àti Àfikún Àwòrán 5). Àwòrán 4 fihàn pé, ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso, ìtọ́jú TGF-β1 dín agbègbè ojú ilẹ̀ àròpín, nọ́mbà ẹ̀ka, gígùn ẹ̀ka lápapọ̀, àti nọ́mbà ìsopọ̀ ẹ̀ka kù (Àwòrán 4A àti B) ó sì yí ìpín mitochondria padà láti ìrísí spinal sí intermediate morphology (Àwòrán 4C). Ìtọ́jú IPA nìkan dín ìwọ̀n mitochondrial lápapọ̀ kù ó sì yí ìpín mitochondria padà láti ìrísí spinal sí intermediate morphology ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso (Àwòrán 4A). Ní ​​ìyàtọ̀ sí èyí, sphericity, average long ti ẹ̀ka, àti iṣẹ́ mitochondrial tí a ṣe àyẹ̀wò nípasẹ̀ mitochondrial membrane potential-dependent MTR (Àwòrán 4A àti E) kò yí padà àti pé àwọn pàrámítà wọ̀nyí kò yàtọ̀ láàrín àwọn ẹgbẹ́. Ní àpapọ̀, àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé ìtọ́jú TGF-β1 àti IPA dàbí ẹni pé ó ń ṣe àtúnṣe ìrísí mitochondrial àti ìtóbi nẹ́tíwọ́ọ̀kì nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 alààyè.
IPA n yi awọn agbara mitochondrial pada ati iye DNA mitochondrial ninu awọn sẹẹli LX-2. A. Awọn aworan confocal aṣoju ti awọn sẹẹli LX-2 laaye ti a fi TGF-β1 (5 ng/ml) ati 1 mM IPA fun wakati 24 ninu alabọde ti ko ni serum ti o fihan awọn nẹtiwọọki mitochondrial ti a fi Mitotracker™ Red CMXRos kun ati awọ buluu nuclei ti a fi DAPI kun. Gbogbo data ni o kere ju awọn aworan 15 fun ẹgbẹ kan. A gba awọn aworan Z-stack 10 fun iru ayẹwo kọọkan. A ṣe agbekalẹ awọn nkan Z-axis kọọkan ni awọn ege 30, ọkọọkan pẹlu sisanra ti 9.86 μm. Iwọn iwọn: 10 μm. B. Awọn ohun aṣoju (mitochondria nikan) ti a da mọ nipa lilo opin adaptive si aworan naa. A ṣe itupalẹ iye ati afiwe awọn asopọ nẹtiwọọki morphological mitochondrial fun gbogbo awọn sẹẹli ninu ẹgbẹ kọọkan. C. Igbagbogbo ti awọn ipin apẹrẹ mitochondrial. Awọn iye ti o sunmọ 0 tọka si awọn apẹrẹ iyipo, ati awọn iye ti o sunmọ 1 tọka si awọn apẹrẹ filamentous. A pinnu akoonu DNA Mitochondrial (mtDNA) D gẹ́gẹ́ bí a ti ṣe àlàyé rẹ̀ nínú Àwọn Ohun èlò àti Àwọn Ọ̀nà. A ṣe àyẹ̀wò E Mitotracker™ Red CMXRos nípa lílo flow cytometry (àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ 30,000) gẹ́gẹ́ bí a ti ṣe àlàyé rẹ̀ nínú Àwọn Ohun èlò àti Àwọn Ọ̀nà. A gbé àwọn dátà kalẹ̀ gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n ± SD, n = àwọn àyẹ̀wò aláìdádúró 3. A ṣe àfiwé ìṣirò nípa lílo ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan àti Bonferroni lẹ́yìn hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Lẹ́yìn náà, a ṣe àyẹ̀wò iye mtDNA nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 gẹ́gẹ́ bí àmì nọ́mbà mitochondrial. Ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso, iye mtDNA pọ̀ sí i nínú ẹgbẹ́ tí a tọ́jú TGF-β1 (Àwòrán 4D). Ní ​​ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ tí a tọ́jú TGF-β1, iye mtDNA dínkù nínú ẹgbẹ́ ìtọ́jú àpapọ̀ (Àwòrán 4D), èyí tí ó fihàn pé IPA lè dín iye mtDNA kù àti bóyá nọ́mbà mitochondrial àti ìmí mitochondrial (Àwòrán 3C). Jù bẹ́ẹ̀ lọ, IPA dàbí ẹni pé ó dín iye mtDNA kù nínú ìtọ́jú àpapọ̀ ṣùgbọ́n kò ní ipa lórí ìṣiṣẹ́ mitochondrial tí MTR ṣe (Àwòrán 4A–C).
A ṣe ìwádìí ìbáṣepọ̀ IPA pẹ̀lú ìpele mRNA ti àwọn jínì tí ó níí ṣe pẹ̀lú fibrosis, apoptosis, ìwàláàyè, àti mitochondrial dynamics nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 (Àwòrán 5A–D). Ní ​​ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso, ẹgbẹ́ tí a tọ́jú TGF-β1 fi ìfarahàn àwọn jínì bí collagen type I α2 chain (COL1A2), α-smooth muscle actin (αSMA), matrix metalloproteinase 2 (MMP2), àsopọ̀ ìdènà ti metalloproteinase 1 (TIMP1), àti dynamin 1-like gene (DRP1), èyí tí ó fi hàn pé fibrosis pọ̀ sí i àti ìṣiṣẹ́. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso, ìtọ́jú TGF-β1 dín ìpele mRNA ti nuclear pregnane X receptor (PXR) kù, caspase 8 (CASP8), MAPKPK3, inhibitor of B-cell α, enhancer of nuclear factor κ gene light peptide (NFκB1A), àti inhibitor of nuclear factor κB kinase subunit β (IKBKB) (Àwòrán 5A–D). Ní ìfiwéra pẹ̀lú ìtọ́jú TGF-β1, ìtọ́jú àpapọ̀ pẹ̀lú TGF-β1 àti IPA dín ìfarahàn COL1A2 àti MMP2 kù, ṣùgbọ́n ó mú kí ìpele mRNA ti PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, àti IKBKB pọ̀ sí i. Ìtọ́jú IPA dín ìfarahàn MMP2, Bcl-2-associated protein X (BAX), AKT1, optic atrophy protein 1 (OPA1), àti mitochondrial fusion protein 2 (MFN2) kù ní pàtàkì, nígbà tí ìfarahàn CASP8, NFκB1A, NFκB1B, àti IKBKB pọ̀ sí i ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso. Síbẹ̀síbẹ̀, a kò rí ìyàtọ̀ kankan nínú ìfarahàn caspase-3 (CASP3), apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1), mitochondrial fusion protein 1 (MFN1), àti fission protein 1 (FIS1). Ní àpapọ̀, àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé ìtọ́jú IPA ń ṣe àtúnṣe ìfarahàn àwọn jínì tí ó níí ṣe pẹ̀lú fibrosis, apoptosis, survival, àti mitochondrial dynamics. Àwọn ìwádìí wa fihàn pé ìtọ́jú IPA dín fibrosis nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 kù; ní àkókò kan náà, ó ń ru ìwàláàyè sókè nípa yíyí irú ẹ̀dá náà padà sí àìṣiṣẹ́.
IPA n ṣe àtúnṣe ìgbékalẹ̀ àwọn jínì fibroblast, apoptotic, viability, àti mitochondrial dynamics nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2. Àwọn histograms ń ṣe àfihàn ìgbékalẹ̀ mRNA ní ìbámu pẹ̀lú ìṣàkóso endogenous (RPLP0 tàbí PPIA) lẹ́yìn tí a fa àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 pẹ̀lú TGF-β1 àti IPA nínú àárín tí kò ní serum fún wákàtí 24. A fi àwọn fibroblast hàn, B fi àwọn sẹ́ẹ̀lì apoptotic hàn, C fi àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó yè, àti D fi ìgbékalẹ̀ jínì mitochondrial dynamics hàn. A gbé àwọn dátà kalẹ̀ gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n ± standard deviation (SD), n = àwọn àdánwò aláìdádúró 3. A ṣe àfiwé ìṣirò nípa lílo ìdánwò ANOVA àti Bonferroni ní ọ̀nà kan. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Lẹ́yìn náà, a ṣe àyẹ̀wò àwọn àyípadà nínú ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì (FSC-H) àti ìṣòro cytoplasmic (SSC-H) nípa lílo flow cytometry (Àwòrán 6A,B), a sì ṣe àyẹ̀wò àwọn àyípadà nínú ìrísí sẹ́ẹ̀lì lẹ́yìn ìtọ́jú IPA nípa lílo transmission electron microscopy (TEM) àti phase contrast microscopy (Àwòrán Àfikún 6A-B). Gẹ́gẹ́ bí a ti ṣe àyẹ̀wò, àwọn sẹ́ẹ̀lì nínú ẹgbẹ́ tí a tọ́jú TGF-β1 pọ̀ sí i ní ìwọ̀n ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso (Àwòrán 6A,B), tí ó ń fi ìfẹ̀síwájú àtijọ́ ti rough endoplasmic reticulum (ER*) àti phagolysosomes (P) hàn, tí ó ń fi ìṣiṣẹ́ hematopoietic stem cell (HSC) hàn (Àwòrán Àfikún 6A). Síbẹ̀síbẹ̀, ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ tí a tọ́jú TGF-β1, ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì, ìṣòro cytoplasmic (Àwòrán 6A,B), àti akoonu ER* dínkù nínú ẹgbẹ́ ìtọ́jú àpapọ̀ TGF-β1 àti IPA (Àwòrán Àfikún 6A). Síwájú sí i, ìtọ́jú IPA dín ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì náà kù, ìṣòro cytoplasm (Àwòrán 6A,B), àkóónú P àti ER* (Àwòrán Àfikún 6A) ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso. Ní àfikún, àkóónú àwọn sẹ́ẹ̀lì apoptotic pọ̀ sí i lẹ́yìn wákàtí 24 ti ìtọ́jú IPA ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso (àwọn ọfà funfun, Àwòrán Àfikún 6B). Ní ​​àpapọ̀, àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé 1 mM IPA le ru apoptosis HSC sókè kí ó sì yí àwọn ìyípadà nínú àwọn pàrámítà morphological sẹ́ẹ̀lì tí TGF-β1 fà padà, nípa bẹ́ẹ̀ ó ń ṣàkóso ìwọ̀n àti ìṣòro sẹ́ẹ̀lì náà, èyí tí ó lè ní í ṣe pẹ̀lú àìṣiṣẹ́ HSC.
IPA n yi iwọn sẹẹli ati idiju cytoplasm ninu awọn sẹẹli LX-2 pada. Awọn aworan aṣoju ti itupalẹ cytometry sisan. Atunyẹwo naa lo ọgbọn gating kan pato fun awọn sẹẹli LX-2: SSC-A/FSC-A lati ṣalaye iye sẹẹli, FSC-H/FSC-A lati ṣe idanimọ awọn doubts, ati SSC-H/FSC-H fun iwọn sẹẹli ati itupalẹ idiju. A fi TGF-β1 (5 ng/ml) ati 1 mM IPA sinu awọn sẹẹli ni alabọde ti ko ni serum fun wakati 24. A pin awọn sẹẹli LX-2 si quadrant apa osi isalẹ (SSC-H-/FSC-H-), quadrant apa osi oke (SSC-H+/FSC-H-), quadrant apa ọtun isalẹ (SSC-H-/FSC-H+), ati quadrant apa ọtun oke (SSC-H+/FSC-H+) fun iwọn sẹẹli ati itupalẹ idiju cytoplasm. B. A ṣe àgbéyẹ̀wò ìrísí sẹ́ẹ̀lì nípa lílo FSC-H (ìtúká síwájú, ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì) àti SSC-H (ìtúká ẹ̀gbẹ́, ìdàpọ̀ cytoplasmic) (àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ 30,000). A gbé àwọn dátà kalẹ̀ gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n ± SD, n = àwọn àdánwò aláìdádúró mẹ́ta. A ṣe àfiwé ìṣirò nípa lílo ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan àti Bonferroni lẹ́yìn hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 àti ****p < 0.0001
Àwọn metabolites ikùn bíi IPA ti di kókó ìwádìí gbígbòòrò, èyí tó ń fihàn pé a lè rí àwọn ibi-afẹ́de tuntun nínú ikùn microbiota. Nítorí náà, ó dùn mọ́ni pé IPA, metabolite kan tí a ti so pọ̀ mọ́ fibrosis ẹ̀dọ̀ nínú ènìyàn [15], ni a ti fihàn pé ó jẹ́ èròjà anti-fibrotic nínú àwọn àpẹẹrẹ ẹranko [13, 14]. Níbí, a fi ìbáṣepọ̀ kan hàn láàárín IPA serum àti transcriptomics liver global àti methylation DNA nínú àwọn ènìyàn tí wọ́n sanra láìsí àtọ̀gbẹ irú kejì (T2D), èyí tó ń ṣe àfihàn apoptosis, mitophagy àti pípẹ́, àti pé ó ṣeé ṣe kí ó jẹ́ jínì AKT1 tó ń ṣàkóso homeostasis liver. Ohun tuntun mìíràn nínú ìwádìí wa ni pé a fi ìbáṣepọ̀ ìtọ́jú IPA pẹ̀lú apoptosis, morphology sẹ́ẹ̀lì, mitochondrial bioenergetics àti dynamics nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 hàn, èyí tó ń fihàn pé agbára díẹ̀ ló ń yí HSC padà sí àìṣiṣẹ́, èyí tó ń jẹ́ kí IPA jẹ́ olùdíje tó ṣeé ṣe fún mímú fibrosis liver sàn.
A rí i pé apoptosis, mitophagy àti gígùn ọjọ́ ayé ni àwọn ipa ọ̀nà pàtàkì tí a fi kún àwọn jínì ẹ̀dọ̀ tí ó ní í ṣe pẹ̀lú IPA nínú ẹ̀jẹ̀. Ìdènà ètò ìṣàkóso dídára mitochondrial (MQC) lè fa àìlera mitochondrial, mitophagy àti apoptosis, èyí sì ń mú kí MASLD wáyé [33, 34]. Nítorí náà, a lè méfò pé IPA lè ní ipa nínú mímú àwọn ìṣiṣẹ́ sẹ́ẹ̀lì àti ìdúróṣinṣin mitochondrial dúró ṣinṣin nípasẹ̀ apoptosis, mitophagy àti gígùn ọjọ́ ayé nínú ẹ̀dọ̀. Àwọn ìwádìí wa fihàn pé àwọn jínì méjì wọ́pọ̀ láàárín àwọn àyẹ̀wò mẹ́ta náà: YKT6 àti AKT1. Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé YKT6 jẹ́ amuaradagba SNARE tí ó ní ipa nínú ìlànà ìdàpọ̀ sẹ́ẹ̀lì. Ó ń kó ipa nínú autophagy àti mitophagy nípa ṣíṣe àgbékalẹ̀ ìpìlẹ̀ pẹ̀lú STX17 àti SNAP29 lórí autophagosome, nípa bẹ́ẹ̀ ó ń gbé ìdàpọ̀ autophagosome àti lysosomes lárugẹ [35]. Síwájú sí i, pípadánù iṣẹ́ YKT6 máa ń yọrí sí àìlera mitophagy[36], nígbàtí ìdàgbàsókè YKT6 níí ṣe pẹ̀lú ìlọsíwájú ti hepatocellular carcinoma (HCC), tí ó ń fi ìdàgbàsókè ti sẹ́ẹ̀lì hàn [37]. Ní ọwọ́ kejì ẹ̀wẹ̀, AKT1 ni jínì tí ó ṣe pàtàkì jùlọ tí ó ń bá ara ṣiṣẹ́, ó sì ń kó ipa pàtàkì nínú àwọn àrùn ẹ̀dọ̀, títí bí ipa ọ̀nà ìfàmì PI3K/AKT, cycle sẹ́ẹ̀lì, ìṣípò sẹ́ẹ̀lì, ìbísí, ìfaradà focal, iṣẹ́ mitochondrial, àti ìyọkúrò collagen [38–40]. Ọ̀nà ìfàmì PI3K/AKT tí a ti mú ṣiṣẹ́ lè mú àwọn sẹ́ẹ̀lì ìpele hematopoietic (HSCs) ṣiṣẹ́, èyí tí ó jẹ́ àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó ń ṣe iṣẹ́ àgbékalẹ̀ extracellular matrix (ECM), àti àìlera rẹ̀ lè ṣe àfikún sí ìṣẹ̀lẹ̀ àti ìlọsíwájú ti fibrosis ẹ̀dọ̀ [40]. Ní àfikún, AKT jẹ́ ọ̀kan lára ​​àwọn ohun pàtàkì tí ó ń fa ìgbẹ̀yìn sẹ́ẹ̀lì tí ó ń dí p53-dependent cell apoptosis lọ́wọ́, àti ìṣiṣẹ́ AKT lè níí ṣe pẹ̀lú ìdíwọ́ ti apoptosis sẹ́ẹ̀lì ẹ̀dọ̀ [41, 42]. Àwọn àbájáde tí a rí fihàn pé IPA lè ní ipa nínú apoptosis tí ó níí ṣe pẹ̀lú mitochondria nínú ẹ̀dọ̀ nípa bíbá ìpinnu àwọn hepatocytes láàárín wíwọlé apoptosis tàbí ìwàláàyè. Àwọn ipa wọ̀nyí lè jẹ́ ìṣàkóso nípasẹ̀ àwọn Jiini AKT àti/tàbí YKT6, èyí tí ó ṣe pàtàkì fún homeostasis ẹ̀dọ̀.
Àwọn àbájáde wa fihàn pé 1 mM IPA fa apoptosis àti ìdínkù ìmí mitochondrial nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 láìsí ìtọ́jú TGF-β1. Ó ṣe pàtàkì pé apoptosis jẹ́ ipa ọ̀nà pàtàkì fún ìṣètò fibrosis àti ìṣiṣẹ́ sẹ́ẹ̀lì hematopoietic stem (HSC), ó sì tún jẹ́ ìṣẹ̀lẹ̀ pàtàkì nínú ìdáhùn ìṣiṣẹ́ ara tí fibrosis ẹ̀dọ̀ ń yípadà [4, 43]. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, ìtúnṣe BHI nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 lẹ́yìn ìtọ́jú àpapọ̀ pèsè òye tuntun sí ipa tí IPA lè kó nínú ìṣàkóso bioenergetics mitochondrial. Lábẹ́ àwọn ipò ìsinmi àti àìṣiṣẹ́, àwọn sẹ́ẹ̀lì hematopoietic sábà máa ń lo mitochondrial oxidative phosphorylation láti ṣe ATP àti ní ìṣiṣẹ́ metabolic díẹ̀. Ní ọwọ́ kejì ẹ̀wẹ̀, ìṣiṣẹ́ HSC mú kí ìmí mitochondrial àti biosynthesis sunwọ̀n síi láti san án padà fún àwọn ìbéèrè agbára tí wíwọlé ipò glycolytic [44]. Òtítọ́ náà pé IPA kò ní ipa lórí agbára metabolic àti ECAR fihàn pé ipa ọ̀nà glycolytic kò ní pàtàkì púpọ̀. Bákan náà, ìwádìí mìíràn fihàn pé 1 mM IPA lè ṣe àtúnṣe ìṣiṣẹ́ ẹ̀wọ̀n atẹ́gùn mitochondrial nínú cardiomyocytes, ìlà sẹ́ẹ̀lì hepatocyte ènìyàn (Huh7) àti àwọn sẹ́ẹ̀lì endothelial ìṣàn ẹ̀jẹ̀ ènìyàn (HUVEC); Síbẹ̀síbẹ̀, a kò rí ipa IPA kankan lórí glycolysis nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì cardiomyocytes, èyí tí ó fihàn pé IPA lè ní ipa lórí bioenergetics ti àwọn irú sẹ́ẹ̀lì mìíràn [45]. Nítorí náà, a rò pé 1 mM IPA lè ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí uncoupler kẹ́míkà díẹ̀, nítorí pé ó lè dín ìfìhàn jínì fibrogenic kù ní pàtàkì, ìrísí sẹ́ẹ̀lì àti mitochondrial bioenergetics láìyípadà iye mtDNA [46]. Àwọn uncouplers Mitochondrial le dènà fibrosis tí ó fa àṣà àti ìṣiṣẹ́ HSC [47] kí ó sì dín ìṣẹ̀dá ATP mitochondrial tí àwọn protein bíi uncoupling proteins (UCP) tàbí adenine nucleotide translocase (ANT) ń ṣe àkóso tàbí tí ó fà. Ní ìbámu pẹ̀lú irú sẹ́ẹ̀lì, ìṣẹ̀lẹ̀ yìí lè dáàbò bo àwọn sẹ́ẹ̀lì kúrò nínú apoptosis àti/tàbí kí ó gbé apoptosis lárugẹ [46]. Sibẹsibẹ, awọn iwadii siwaju sii ni a nilo lati ṣalaye ipa IPA gẹgẹbi isọdọkan mitochondrial ninu idinku awọn sẹẹli hematopoietic.
Lẹ́yìn náà, a ṣe ìwádìí bóyá àwọn àyípadà nínú ìmí mitochondrial hàn nínú ìrísí mitochondrial nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 alààyè. Lóòótọ́, ìtọ́jú TGF-β1 yí ìwọ̀n mitochondrial padà láti spheric sí intermediate, pẹ̀lú ìdínkù ẹ̀ka mitochondrial àti ìfarahàn DRP1 tí ó pọ̀ sí i, ohun pàtàkì nínú ìfọ́ mitochondrial [48]. Síwájú sí i, ìfọ́ mitochondrial ní í ṣe pẹ̀lú ìdàpọ̀ gbogbo nẹ́ẹ̀tìwọ́ọ̀kì, àti ìyípadà láti ìfọ́pọ̀ sí ìfọ́ ṣe pàtàkì fún ìṣiṣẹ́ sẹ́ẹ̀lì stem hematopoietic (HSC), nígbàtí ìdínà ìfọ́ mitochondrial yọrí sí apoptosis HSC [49]. Nítorí náà, àwọn àbájáde wa fihàn pé ìtọ́jú TGF-β1 le fa ìdínkù nínú ìdàpọ̀ nẹ́ẹ̀tìwọ́ọ̀kì mitochondrial pẹ̀lú ìdínkù ẹ̀ka, èyí tí ó wọ́pọ̀ jùlọ nínú ìfọ́ mitochondrial tí ó ní í ṣe pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì stem hematopoietic tí a ti ṣiṣẹ́ (HSCs). Jù bẹ́ẹ̀ lọ, àwọn ìwádìí wa fihàn pé IPA le yí ìwọ̀n mitochondria padà láti spheric sí intermediate apẹrẹ, nípa bẹ́ẹ̀ ó dín ìfarahàn OPA1 àti MFN2 kù. Àwọn ìwádìí ti fihàn pé ìdínkù OPA1 le fa ìdínkù nínú agbára membrane mitochondrial àti ìfàsẹ́yìn apoptosis sẹ́ẹ̀lì [50]. A mọ̀ pé MFN2 ló ń ṣe àtúnṣe ìfọwọ́sowọ́pọ̀ mitochondrial àti apoptosis [51]. Àwọn èsì tí a rí fihàn pé ìfàsẹ́yìn àwọn sẹ́ẹ̀lì LX-2 nípasẹ̀ TGF-β1 àti/tàbí IPA dàbí ẹni pé ó ń ṣe àtúnṣe ìrísí àti ìwọ̀n mitochondrial, àti ipò ìṣiṣẹ́ àti ìṣòro nẹ́tíwọ́ọ̀kì.
Àwọn àbájáde wa fihàn pé ìtọ́jú àpapọ̀ TGFβ-1 àti IPA lè dín mtDNA àti àwọn pàrámítà ìrísí sẹ́ẹ̀lì kù nípa ṣíṣàkóso ìfarahàn mRNA ti fibrosis, apoptosis àti àwọn jínì tí ó níí ṣe pẹ̀lú ìwàláàyè nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ń sá fún apoptosis. Ní tòótọ́, IPA dín ìpele ìfarahàn mRNA ti AKT1 àti àwọn jínì fibrosis pàtàkì bíi COL1A2 àti MMP2 kù, ṣùgbọ́n ó mú kí ìpele ìfarahàn CASP8 pọ̀ sí i, èyí tí ó níí ṣe pẹ̀lú apoptosis. Àwọn àbájáde wa fihàn pé lẹ́yìn ìtọ́jú IPA, ìfarahàn BAX dínkù àti ìfarahàn mRNA ti àwọn ẹ̀yà TIMP1 ìdílé, BCL-2 àti NF-κB pọ̀ sí i, èyí tí ó fihàn pé IPA lè ru àwọn àmì ìwàláàyè sókè nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì ìrísí hematopoietic (HSCs) tí ó yẹra fún apoptosis. Àwọn mólẹ́ẹ̀lì wọ̀nyí lè ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí àwọn àmì ìfarahàn pro-survival nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì ìrísí hematopoietic tí a ti ṣiṣẹ́, èyí tí ó lè níí ṣe pẹ̀lú ìfarahàn púpọ̀ ti àwọn prótéènì anti-apoptotic (bíi Bcl-2), ìdínkù ìfarahàn pro-apoptotic BAX, àti ìbáṣepọ̀ dídíjú láàrín TIMP àti NF-κB [5, 7]. IPA n lo ipa rẹ̀ nípasẹ̀ PXR, a sì rí i pé ìtọ́jú àpapọ̀ pẹ̀lú TGF-β1 àti IPA mú kí àwọn ipele ìfarahàn PXR mRNA pọ̀ sí i, èyí tí ó ń fi hàn pé ìfàsẹ́yìn ìṣiṣẹ́ HSC ti dínkù. Ìfihàn PXR tí a ti mú ṣiṣẹ́ ni a mọ̀ láti dí ìṣiṣẹ́ HSC lọ́wọ́ ní in vivo àti in vitro [52, 53]. Àwọn àbájáde wa fihàn pé IPA le kópa nínú píparí àwọn HSC tí a ti mú ṣiṣẹ́ nípa gbígbé apoptosis lárugẹ, dín fibrosis àti mitochondrial metabolism kù, àti mímú àwọn àmì ìwàláàyè pọ̀ sí i, èyí tí ó jẹ́ àwọn ìlànà tí ó wọ́pọ̀ tí ó yí phenotype HSC tí a ti mú ṣiṣẹ́ padà sí èyí tí a kò ti mú ṣiṣẹ́. Àlàyé mìíràn tí ó ṣeé ṣe fún ìlànà àti ipa tí IPA lè kó nínú apoptosis ni pé ó ń pa mitochondria tí kò ṣiṣẹ́ dáradára run ní pàtàkì nípasẹ̀ mitophagy (ọ̀nà inú) àti ọ̀nà ìfihàn TNF tí ó jáde (Tábìlì 1), èyí tí ó so mọ́ ọ̀nà ìfihàn ìwàláàyè NF-κB (Àwòrán Àfikún 7). Ó yani lẹ́nu pé àwọn jínì tí ó ní ipa lórí IPA lè fa àwọn àmì ìfàmọ́ra àti ìfàmọ́ra nínú ipa ọ̀nà apoptotic [54], èyí tí ó fihàn pé IPA lè fa ipa ọ̀nà apoptotic tàbí ìfàmọ́ra nípa ṣíṣe ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú àwọn jínì wọ̀nyí. Síbẹ̀síbẹ̀, bí IPA ṣe ń fa apoptosis tàbí ìfàmọ́ra nígbà tí a bá ń mú HSC ṣiṣẹ́ àti àwọn ipa ọ̀nà rẹ̀ kò tíì yéni.
IPA jẹ́ ìṣẹ̀dá microbial metabolite tí a ṣe láti inú tryptophan oúnjẹ nípasẹ̀ microbiota ikùn. Àwọn ìwádìí ti fihàn pé ó ní àwọn ohun-ìní ìdènà ìgbóná ara, antioxidant, àti epigenetic nínú àyíká ìfun.[55] Àwọn ìwádìí ti fihàn pé IPA le ṣe àtúnṣe iṣẹ́ ìdènà ìfun àti dín wahala oxidative kù, èyí tí ó le ṣe àfikún sí àwọn ipa ìṣiṣẹ́ ara agbègbè rẹ̀.[56] Ní tòótọ́, a ń gbé IPA lọ sí àwọn ẹ̀yà ara tí a fojú sí nípasẹ̀ ìṣàn ẹ̀jẹ̀, àti níwọ̀n ìgbà tí IPA ní ìṣètò metabolite pàtàkì kan náà pẹ̀lú tryptophan, serotonin, àti indole derivatives, IPA ń ṣe àwọn ìgbésẹ̀ ìṣètò tí ó ń yọrí sí àwọn àyànmọ́ ìṣètò tí ó ń díje.[52] IPA le díje pẹ̀lú àwọn metabolites tí a ti tryptophan jáde fún àwọn ibi ìsopọ̀ lórí àwọn enzymes tàbí àwọn olugba, èyí tí ó lè ba àwọn ipa ọ̀nà ìṣètò déédéé jẹ́. Èyí ń tẹnu mọ́ àìní fún àwọn ìwádìí síwájú síi lórí pharmacokinetics àti pharmacodynamics rẹ̀ láti lóye window ìtọ́jú rẹ̀ dáadáa.[57] A ṣì ń rí i bóyá èyí tún lè ṣẹlẹ̀ nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì ìpìlẹ̀ hematopoietic (HSCs).
A gbà pé ìwádìí wa ní àwọn ààlà díẹ̀. Láti ṣe àyẹ̀wò àwọn ìbáṣepọ̀ tí ó níí ṣe pẹ̀lú IPA ní pàtó, a yọ àwọn aláìsàn tí wọ́n ní àrùn àtọ̀gbẹ irú kejì (T2DM) kúrò. A gbà pé èyí dín ìlò gbogbo àwọn àwárí wa kù fún àwọn aláìsàn tí wọ́n ní àrùn àtọ̀gbẹ irú kejì àti àrùn ẹ̀dọ̀ tí ó ti pẹ́. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ìfojúsùn ara ti IPA nínú ẹ̀jẹ̀ ènìyàn jẹ́ 1–10 μM [11, 20], a yan ìfojúsùn 1 mM IPA ní ìbámu pẹ̀lú ìfojúsùn tí kò ní majele tí ó ga jùlọ [15] àti ìwọ̀n apoptosis tí ó ga jùlọ, láìsí ìyàtọ̀ nínú ìpíndọ́gba iye àwọn sẹ́ẹ̀lì necrotic. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a lo ìpele supraphysiological ti IPA nínú ìwádìí yìí, kò sí ìfohùnṣọ̀kan lọ́wọ́lọ́wọ́ nípa ìwọ̀n tí ó múná dóko ti IPA [52]. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn àbájáde wa ṣe pàtàkì, ìpíndọ́gba ìṣẹ̀dá tí ó gbòòrò ti IPA ṣì jẹ́ agbègbè ìwádìí tí ń ṣiṣẹ́. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, àwọn àwárí wa lórí ìbáṣepọ̀ láàárín ìpele IPA nínú ẹ̀jẹ̀ àti methylation DNA ti àwọn àkọsílẹ̀ ẹ̀dọ̀ ni a gba kìí ṣe láti inú àwọn sẹ́ẹ̀lì hematopoietic stem (HSCs) nìkan ṣùgbọ́n láti inú àwọn àsopọ ẹ̀dọ̀ pẹ̀lú. A yan lati lo awọn sẹẹli LX-2 eniyan ni ibamu si awọn awari wa ti tẹlẹ lati inu itupalẹ transcriptome pe IPA ni nkan ṣe pẹlu imuṣiṣẹ sẹẹli hematopoietic (HSC) [15], ati pe awọn HSC ni awọn sẹẹli pataki ti o ni ipa ninu ilọsiwaju ti fibrosis ẹdọ. Ẹdọ ni a ṣe ni ọpọlọpọ awọn iru sẹẹli, nitorinaa awọn awoṣe sẹẹli miiran bii eto co-culture cell hepatocyte-HSC ti a papọ pẹlu imuṣiṣẹ caspase ati pipin DNA bakanna bi ilana iṣe pẹlu ipele amuaradagba yẹ ki o ronu lati ṣe iwadi ipa ti IPA ati ibaraenisepo rẹ pẹlu awọn iru sẹẹli ẹdọ miiran.