Àpilẹ̀kọ náà jẹ́ ara kókó ìwádìí náà “Mímú kí àwọn èèpo náà lè fara da àwọn kòkòrò àrùn àti àwọn kòkòrò àrùn”, wo gbogbo àpilẹ̀kọ márùn-ún náà.
Ohun tó ń fa àrùn ewéko olu nicrosis Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary lo ọ̀nà ìṣètò tó ní ìpele púpọ̀ láti kó àrùn ran àwọn ewéko tó wà nílé ìwòsàn. Ìwádìí yìí dábàá lílo diamine L-ornithine, amino acid tí kì í ṣe amuaradagba tó ń ru ìṣẹ̀dá àwọn amino acid pàtàkì mìíràn sókè, gẹ́gẹ́ bí ọ̀nà ìtọ́jú mìíràn láti mú kí àwọn ìdáhùn molecule, physiological àti biochemical ti Phaseolus vulgaris L. pọ̀ sí ewé funfun tí Pseudomonas sclerotiorum fà. Àwọn ìwádìí In vitro fihàn pé L-ornithine dí ìdàgbàsókè mycelial ti S. pyrenoidosa lọ́wọ́ ní ọ̀nà tó da lórí ìwọ̀n. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, ó lè dín bí ewéko funfun ṣe le tó kù lábẹ́ àwọn ipò ewéko. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, L-ornithine ru ìdàgbàsókè àwọn ewéko tí a tọ́jú sókè, èyí tó fihàn pé ìwọ̀n L-ornithine tí a dán wò kò léwu sí àwọn ewéko tí a tọ́jú. Ní àfikún, L-ornithine mú kí ìfarahàn àwọn antioxidants tí kìí ṣe enzymatic (àwọn phenolics àti flavonoids tí ó lè yọ́) àti àwọn antioxidants enzymatic (catalase (CAT), peroxidase (POX), àti polyphenol oxidase (PPO)) pọ̀ sí i, ó sì mú kí ìfarahàn àwọn jiini mẹ́ta tí ó níí ṣe pẹ̀lú antioxidant pọ̀ sí i (PvCAT1, PvSOD, àti PvGR). Jù bẹ́ẹ̀ lọ, nínú ìwádìí silico fi hàn pé protein oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) wà nínú genome S. sclerotiorum, èyí tí ó jọra gan-an pẹ̀lú àwọn protein oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) ti Aspergillus fijiensis (AfOAH) àti Penicillium sp. (PlOAH) ní ti ìṣàyẹ̀wò iṣẹ́, àwọn agbègbè tí a ti pa mọ́, àti topology. Lọ́nà tí ó yani lẹ́nu, fífi L-ornithine kún omi ọ̀fọ̀ dextrose (PDB) dín ìfarahàn jiini SsOAH kù ní S. sclerotiorum mycelia. Bákan náà, lílo L-ornithine láti ara àwọn ohun ọ̀gbìn tí a ti tọ́jú dín ìfarahàn jínì SsOAH kù ní pàtàkì nínú mycelia fúngus tí a kó láti inú àwọn ohun ọ̀gbìn tí a ti tọ́jú. Níkẹyìn, lílo L-ornithine dín ìtújáde oxalic acid kù ní pàtàkì nínú àwọn ewé PDB àti àwọn ewé tí ó ní àkóràn. Ní ìparí, L-ornithine kó ipa pàtàkì nínú mímú ipò redox dúró àti mímú ìdáhùn ààbò àwọn ohun ọ̀gbìn tí ó ní àkóràn pọ̀ sí i. Àwọn àbájáde ìwádìí yìí lè ran lọ́wọ́ láti ṣe àgbékalẹ̀ àwọn ọ̀nà tuntun, tí ó rọrùn fún àyíká láti ṣàkóso mọ́ọ̀lù funfun àti láti dín ipa rẹ̀ lórí ìṣelọ́pọ́ ewéko àti àwọn ohun ọ̀gbìn mìíràn kù.
Mọ́l funfun, tí a ń pè ní Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ń fà, jẹ́ àrùn tó ń dín ìbísí kù, tó sì ń fa ewu ńlá fún ìṣẹ̀dá ewa kárí ayé (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum jẹ́ ọ̀kan lára ​​àwọn àrùn ewéko olu tó ṣòro jùlọ láti ṣàkóso, pẹ̀lú onírúurú ohun ọ̀gbìn tó lé ní 600 àti agbára láti yára pa àwọn àsopọ̀ ara ilé ní ọ̀nà tí kò ṣe pàtó (Liang àti Rollins, 2018). Lábẹ́ àwọn ipò tí kò dára, ó máa ń gba ipò pàtàkì nínú ìgbésí ayé rẹ̀, ó sì máa ń dúró fún ìgbà pípẹ́ gẹ́gẹ́ bí àwọn ohun ọ̀gbìn dúdú, líle, tí wọ́n ń pè ní 'sclerotia' nínú ilẹ̀ tàbí gẹ́gẹ́ bí àwọn ìdàgbàsókè funfun, tó ní ìrísí nínú mycelium tàbí ìpìlẹ̀ àwọn ohun ọ̀gbìn tó ní àkóràn (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum le ṣẹda sclerotia, eyiti o fun laaye lati wa laaye ni awọn aaye ti o ni akoran fun igba pipẹ ati lati duro lakoko aisan (Schwartz et al., 2005). Sclerotia jẹ ọlọrọ ni awọn eroja, o le duro ninu ile fun igba pipẹ, ati ṣiṣẹ bi inoculum akọkọ fun awọn akoran ti o tẹle (Schwartz et al., 2005). Labẹ awọn ipo ti o dara, sclerotia n dagba ati ṣe awọn spores afẹfẹ ti o le ṣe akoran gbogbo awọn apakan ti o wa loke ilẹ ti ọgbin, pẹlu ṣugbọn kii ṣe opin si awọn ododo, awọn igi, tabi awọn pods (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum lo ọgbọn eto-ọna pupọ lati ko arun lara awọn eweko ti o gbalejo rẹ, ti o ni awọn iṣẹlẹ ti a ṣeto lati ibisi sclerotial si idagbasoke awọn aami aisan. Ni akọkọ, S. sclerotiorum n ṣe awọn spores ti a da duro (ti a pe ni ascospores) lati awọn ẹya ti o dabi olu ti a pe ni apothecia, ti o di afẹfẹ ti o si di sclerotia ti ko ni gbigbe lori awọn idoti ọgbin ti o ni akoran (Bolton et al., 2006). Olu naa lẹhinna n tu oxalic acid jade, ifosiwewe virulence, lati ṣakoso pH ogiri sẹẹli ọgbin, ṣe igbelaruge ibajẹ enzymatic ati ikọlu ti àsopọ (Hegedus ati Rimmer, 2005), ati lati dẹkun bugbamu oxidative ti ọgbin ti o gbalejo. Ilana acidification yii n mu odi sẹẹli ọgbin di alailera, pese agbegbe ti o dara fun iṣẹ deede ati ṣiṣe daradara ti awọn enzymes ti o bajẹ ogiri sẹẹli olu (CWDEs), gbigba awọn kokoro arun laaye lati bori idena ti ara ati wọ inu awọn ara olugbalejo (Marciano et al., 1983). Nígbà tí a bá ti wọ inú rẹ̀, S. sclerotiorum máa ń tú ọ̀pọ̀lọpọ̀ CWDE jáde, bíi polygalacturonase àti cellulase, èyí tí ó ń mú kí ìtànkálẹ̀ rẹ̀ rọrùn nínú àwọn àsopọ̀ tí ó ní àkóràn, tí ó sì ń fa necrosis àsopọ̀. Ìlọsíwájú àwọn ọgbẹ́ àti àwọn aṣọ hyphal máa ń yọrí sí àwọn àmì àmì ti mọ́ọ̀lù funfun (Hegedus àti Rimmer, 2005). Ní ​​àkókò kan náà, àwọn ohun ọ̀gbìn tí ó gbàlejò máa ń mọ àwọn àpẹẹrẹ mọ́ọ̀lù tí ó níí ṣe pẹ̀lú pathogen (PAMPs) nípasẹ̀ àwọn olugba ìdámọ̀ àpẹẹrẹ (PRRs), èyí tí ó ń fa àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ àmì tí ó ń mú kí àwọn ìdáhùn ìdáàbòbò ṣiṣẹ́ nígbẹ̀yìn gbẹ́yín.
Láìka ọ̀pọ̀ ọdún tí a ti ń gbìyànjú láti ṣàkóso àrùn sí, àìtó àwọn germplasm tó lè dènà àrùn tó péye ṣì wà nínú ewa, gẹ́gẹ́ bí ó ti rí nínú àwọn irúgbìn mìíràn tí wọ́n ń tà, nítorí àìfaradà, ìwàláàyè, àti bí a ṣe lè yí padà ti àrùn náà. Nítorí náà, ìṣàkóso àrùn jẹ́ ìpèníjà gidigidi, ó sì nílò ètò ìṣètò tó ní onírúurú ọ̀nà tí ó ní àpapọ̀ àwọn ìṣe àṣà, ìṣàkóso ẹ̀dá alààyè, àti àwọn ohun èlò ìpakúpa oníkẹ́míkà (O'Sullivan et al., 2021). Ìṣàkóso kẹ́míkà ti mọ́ọ̀lù funfun ló múná dóko jùlọ nítorí pé àwọn ohun èlò ìpakúpa oníkẹ́míkà, tí a bá lò ó dáadáa àti ní àkókò tó tọ́, lè ṣàkóso ìtànkálẹ̀ àrùn náà dáadáa, dín bí àkóràn ṣe le tó kù, kí ó sì dín àdánù èso kù. Síbẹ̀síbẹ̀, lílo jù àti gbígbẹ́kẹ̀lé àwọn ohun èlò ìpakúpa oníkẹ́míkà lè yọrí sí ìfarahàn àwọn irú S. sclerotiorum tó lè dènà àrùn náà, kí ó sì ní ipa búburú lórí àwọn ohun alààyè tí kì í ṣe àfojúsùn, ìlera ilẹ̀, àti dídára omi (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Nítorí náà, wíwá àwọn ọ̀nà míì tó dára fún àyíká ti di ohun pàtàkì jùlọ.
Àwọn polyamines (PAs), bíi putrescine, spermidine, spermine, àti cadaverine, lè ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí àwọn ohun mìíràn tó dájú láti kojú àwọn kòkòrò àrùn ewéko tí ilẹ̀ ń fà, nípa bẹ́ẹ̀ wọ́n lè dín lílo àwọn ohun èlò ìpalára eléwu tàbí díẹ̀ kù (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Nínú àwọn ewéko gíga, àwọn PA ń kópa nínú ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìlànà ìṣiṣẹ́ ara pẹ̀lú, ṣùgbọ́n kìí ṣe títí dé, pípín sẹ́ẹ̀lì, ìyàtọ̀, àti ìdáhùn sí àwọn ìdààmú abiotic àti biotic (Killiny and Nehela, 2020). Wọ́n lè ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí àwọn antioxidants, wọ́n lè ran àwọn ẹ̀yà oxygen reactive lọ́wọ́ láti pa àwọn ohun èlò atẹ́gùn tí ń ṣiṣẹ́ (ROS), wọ́n lè tọ́jú homeostasis redox (Nehela àti Killiny, 2023), wọ́n lè fa àwọn jiini tí ó ní í ṣe pẹ̀lú ààbò (Romero et al., 2018), wọ́n lè ṣàkóso onírúurú ipa ọ̀nà ìṣiṣẹ́ ara (Nehela àti Killiny, 2023), wọ́n lè ṣàkóso àwọn phytohormones tí ó wà nínú ara (Nehela àti Killiny, 2019), wọ́n lè fìdí resistance tí a gbà (SAR múlẹ̀), wọ́n sì lè ṣàkóso ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú àwọn ohun ọ̀gbìn àti àwọn àrùn (Nehela àti Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé àwọn ìlànà pàtó àti ipa tí àwọn PA ń kó nínú ààbò ewéko yàtọ̀ síra ní ìbámu pẹ̀lú irú ewéko, àwọn àrùn, àti àwọn ipò àyíká. PA tí ó pọ̀ jùlọ nínú ewéko ni a fi biosynthesized láti inú polyamine L-ornithine tí ó ṣe pàtàkì (Killiny àti Nehela, 2020).
L-ornithine kó ipa pupọ ninu idagbasoke ati idagbasoke eweko. Fun apẹẹrẹ, awọn iwadi iṣaaju ti fihan pe ninu iresi (Oryza sativa), ornithine le ni nkan ṣe pẹlu atunlo nitrogen (Liu et al., 2018), ikore iresi, didara ati oorun didun (Lu et al., 2020), ati idahun wahala omi (Yang et al., 2000). Pẹlupẹlu, lilo L-ornithine ti o jade ti mu ifarada ogbele pọ si ni pataki ninu suga beet (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) ati idinku wahala iyọ ninu awọn eweko (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu ati Çavuşoǧlu, 2021) ati cashew (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Ipa ti o ṣeeṣe ti L-ornithine ninu aabo wahala abiotic le jẹ nitori ikopa rẹ ninu ikojọpọ proline ninu awọn eweko ti a ti tọju. Fún àpẹẹrẹ, àwọn jínì tó níí ṣe pẹ̀lú ìṣiṣẹ́ proline, bíi ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) àti proline dehydrogenase (ProDH1 àti ProDH2), ni a ti ròyìn tẹ́lẹ̀ pé wọ́n ní ipa nínú ààbò Nicotiana benthamiana àti Arabidopsis thaliana lòdì sí àwọn ẹ̀yà Pseudomonas syringae tí kìí ṣe olùgbàlejò (Senthil-Kumar àti Mysore, 2012). Ní ​​ọwọ́ kejì ẹ̀wẹ̀, a nílò fungal ornithine decarboxylase (ODC) fún ìdàgbàsókè àkóràn (Singh et al., 2020). Fífojúsùn ODC ti Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici nípasẹ̀ ìdènà jínì tí a fi host-induced gene silencing (HIGS) mú kí ìdènà àwọn igi tòmátì pọ̀ sí Fusarium wilt ní pàtàkì (Singh et al., 2020). Síbẹ̀síbẹ̀, ipa tí lílo exogenous ornithine lòdì sí àwọn ìdààmú biotic bíi phytopathogens kò tíì ṣe àyẹ̀wò dáadáa. Èyí tó ṣe pàtàkì jùlọ ni pé, ipa ornithine lórí ìdènà àrùn àti àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ biochemical àti physiological tó ní í ṣe pẹ̀lú rẹ̀ kò tíì ṣe àwárí púpọ̀.
Lílóye ìṣòro àkóràn S. sclerotiorum nínú ewébẹ̀ ṣe pàtàkì fún ìdàgbàsókè àwọn ọgbọ́n ìṣàkóso tó gbéṣẹ́. Nínú ìwádìí yìí, a fẹ́ mọ ipa tí diamine L-ornithine lè kó gẹ́gẹ́ bí kókó pàtàkì nínú mímú kí àwọn ọ̀nà ìgbèjà àti ìdènà àwọn ewébẹ̀ legume pọ̀ sí i sí àkóràn Sclerotinia sclerotiorum. A gbà pé, ní àfikún sí mímú kí àwọn ìdáhùn ààbò àwọn ewébẹ̀ tí ó ní àkóràn pọ̀ sí i, L-ornithine tún kó ipa pàtàkì nínú mímú ipò redox dúró. A dámọ̀ràn pé àwọn ipa tí L-ornithine lè ní í ṣe pẹ̀lú ìṣàkóso àwọn ọ̀nà ìgbèjà antioxidant enzymatic àti non-enzymatic àti ìdènà pẹ̀lú àwọn ohun tó ń fa àrùn/virulence fún ewébẹ̀ àti àwọn protein tó so mọ́ ọn. Iṣẹ́ méjì yìí ti L-ornithine mú kí ó jẹ́ ẹni tó ní ìrètí fún ètò ìgbèjà tó lè pẹ́ láti dín ipa ewébẹ̀ funfun kù àti láti mú kí ìdènà àwọn ewébẹ̀ legume tó wọ́pọ̀ sí àrùn olu tó lágbára yìí pọ̀ sí i. Àwọn àbájáde ìwádìí yìí lè ran lọ́wọ́ nínú ìdàgbàsókè àwọn ọ̀nà tuntun, tó dára fún àyíká láti ṣàkóso ewébẹ̀ funfun àti láti dín ipa rẹ̀ lórí ìṣẹ̀dá ewébẹ̀ kù.
Nínú ìwádìí yìí, a lo oríṣi ewa tí ó lè wúlò fún ìtajà, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), gẹ́gẹ́ bí ohun èlò ìdánwò. Ẹ̀ka Ìwádìí Legume, Field Crops Research Institute (FCRI), Agricultural Research Center (ARC), Egypt, pèsè irúgbìn aláápọn. A gbin irúgbìn márùn-ún sínú ìkòkò ike (ìwọ̀n àárín 35 cm, jíjìn 50 cm) tí a fi ilẹ̀ tí ó ní àrùn S. sclerotiorum kún lábẹ́ àwọn ipò ewéko (25 ± 2 °C, ọ̀rinrin ìbáramu 75 ± 1%, ìmọ́lẹ̀ wákàtí 8/òkùnkùn wákàtí 16). Ní ​​ọjọ́ 7–10 lẹ́yìn gbígbìn (DPS), a ti gé àwọn irúgbìn náà kí wọ́n lè fi àwọn irúgbìn méjì tí wọ́n ní ìdàgbàsókè kan náà àti ewé mẹ́ta tí ó fẹ̀ pátápátá sílẹ̀ nínú ìkòkò kọ̀ọ̀kan. A ń fún gbogbo àwọn igi inú ìkòkò ní omi lẹ́ẹ̀kan ní ọ̀sẹ̀ méjì, a sì ń fi ìdàgbàsókè sílẹ̀ lóṣooṣù ní ìwọ̀n tí a gbà nímọ̀ràn fún irúgbìn tí a fúnni.
Láti pèsè ìṣọ̀kan L-ornithinediamine 500 mg/L (tí a tún mọ̀ sí (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany), a kọ́kọ́ tú 50 mg sínú 100 mL ti omi tí a ti tú jáde. Lẹ́yìn náà, a ti tú omi tí a fi pamọ́ náà dànù, a sì lò ó nínú àwọn àyẹ̀wò tó tẹ̀lé e. Ní kúkúrú, a dán ìsọ̀rí mẹ́fà ti L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100, àti 125 mg/L wò nínú vitro. Ní àfikún, a lo omi tí a ti tú jáde gẹ́gẹ́ bí ìṣàkóṣo odi (Mock) àti ìpara olóró “Rizolex-T” 50% lulú wettable (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypt) gẹ́gẹ́ bí ìṣàkóṣo rere. A dán an wò nínú àyẹ̀wò oògùn olóró tí wọ́n ń pè ní “Rizolex-T” ní in vitro ní ìwọ̀n márùn-ún (2, 4, 6, 8 àti 10 mg/L).
Àwọn àpẹẹrẹ igi ewa àti èèpo tí ó wọ́pọ̀ tí ó ń fi àmì àrùn funfun hàn (ìwọ̀n àkóràn: 10–30%) ni a kó láti oko ìṣòwò. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a fi irú/oríṣiríṣi ohun èlò ewéko tí ó ní àkóràn hàn (irú Giza 3 tí ó ṣeé fara hàn ní ọjà ìtajà), àwọn mìíràn, pàápàá jùlọ àwọn tí a rí láti ọjà ìbílẹ̀, jẹ́ ti irú àwọn ẹ̀yà tí a kò mọ̀. A kọ́kọ́ fi omi sodium hypochlorite 0.5% tí ó ní àkóràn pa ojú ilẹ̀ mọ́, a sì fi omi tí a ti yọ kúrò ní ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìgbà, a sì fi ìwé àlẹ̀mọ́ tí ó ní àkóràn nù ún láti mú omi tí ó pọ̀ jù kúrò. Lẹ́yìn náà, a gé àwọn ẹ̀yà ara tí ó ní àkóràn náà sí àwọn ègé kékeré láti inú àsopọ àárín (láàrín àwọn àsopọ tí ó ní ìlera àti àwọn tí ó ní àkóràn), a gbìn wọ́n sínú dextrose agar (PDA) tí a sì fi sínú ààrin ní 25 ± 2 °C pẹ̀lú ìmọ́lẹ̀ wákàtí 12/àyíká òkùnkùn wákàtí 12 fún ọjọ́ márùn-ún láti mú kí sclerotia ṣẹ̀dá. A tún lo ọ̀nà mycelial tip láti wẹ àwọn àyọkà olu kúrò nínú àwọn àṣà tí ó ní ìdàpọ̀ tàbí tí ó ní àkóràn mọ́. A kọ́kọ́ dá ìyàsọ́tọ̀ olu tí a ti wẹ̀ mọ́ mọ̀ nípa àwọn ànímọ́ àṣà rẹ̀, lẹ́yìn náà a fìdí rẹ̀ múlẹ̀ pé ó jẹ́ S. sclerotiorum ní ìbámu pẹ̀lú àwọn ànímọ́ aláìlágbára. Níkẹyìn, a dán gbogbo àwọn ìyàsọ́tọ̀ tí a ti wẹ̀ mọ́ wò fún àrùn lórí irú ewa Giza 3 tí ó lè farapa láti bá àwọn èrò Koch mu.
Ní àfikún, a tún fi ìdí S. sclerotiorum isolate (isolate #3) tó burú jùlọ múlẹ̀ nípa lílo ìtẹ̀léra spacer (ITS) gẹ́gẹ́ bí White et al., 1990 ṣe ṣàlàyé rẹ̀; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Ní kúkúrú, a gbin àwọn isolates sínú omi ọbẹ̀ dextrose potato (PDB) a sì fi sínú 25 ± 2 °C fún ọjọ́ 5–7. Lẹ́yìn náà, a kó mycelium fungal jọ, a fi cheesecloth sẹ́, a fọ̀ ọ́ lẹ́ẹ̀mejì pẹ̀lú omi sterile, a sì fi ìwé filter sterile gbẹ ẹ́. A ya DNA genomic sọ́tọ̀ nípa lílo Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Lẹ́yìn náà, a mú agbègbè ITS rDNA pọ̀ sí i nípa lílo àkójọpọ̀ pàtàkì ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; ìwọ̀n tí a retí: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Àwọn ọjà PCR tí a ti sọ di mímọ́ ni a fi sílẹ̀ fún ìtẹ̀léra (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). A ṣe ìtẹ̀léra àwọn ìtẹ̀léra ITS rDNA ní ọ̀nà méjì nípa lílo ọ̀nà ìtẹ̀léra Sanger. Lẹ́yìn náà, a fi àwọn ìtẹ̀léra ìbéèrè tí a kó jọ wéra pẹ̀lú àwọn dátà tuntun ní GenBank àti National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) nípa lílo sọ́fítíwọ́ọ̀dù BLASTn. A fi ìtẹ̀lé ìbéèrè náà wéra pẹ̀lú àwọn ẹ̀yà/ìyàsọtọ̀ S. sclerotiorum 20 mìíràn tí a rí gbà láti inú dátà tuntun nínú NCBI GenBank (Àfikún Táblì S1) nípa lílo ClustalW nínú Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; ẹ̀yà 11) (Kumar et al., 2024). A ṣe ìwádìí ìdàgbàsókè nípa lílo ọ̀nà ìṣeéṣe tó pọ̀ jùlọ àti àwòṣe ìyípadà nucleotide ti àkókò gbogbogbòò (Nei àti Kumar, 2000). A fi igi tí ó ní ìṣeéṣe tó ga jùlọ hàn. A yan igi àkọ́kọ́ fún ìwákiri heuristic nípa yíyan igi tí ó ní ìṣeéṣe log-tó ga jùlọ láàárín igi tí ó sopọ̀ mọ́ aládùúgbò (NJ) (Kumar et al., 2024) àti igi parsimony tó pọ̀ jùlọ (MP). A kọ́ igi NJ nípa lílo matrix ijinna méjì-méjì tí a ṣírò nípa lílo àwòṣe àkókò gbogbogbòò (Nei àti Kumar, 2000).
A ṣe àgbékalẹ̀ ìṣiṣẹ́ bakitéríà L-ornithine àti “Rizolex-T” láti inú ìtọ́jú bakitéríà nípasẹ̀ ọ̀nà ìtànkálẹ̀ agar. Ọ̀nà: Mu iye omi ìtọ́jú L-ornithine tó yẹ (500 mg/L) kí o sì dapọ̀ mọ́ 10 milimita ti ohun èlò PDA láti pèsè àwọn omi ìtọ́jú pẹ̀lú ìpele ìkẹyìn ti 12.5, 25, 50, 75, 100 àti 125 mg/L, lẹ́sẹẹsẹ. A lo ìpele márùn-ún ti ohun èlò ìtọ́jú bakitéríà “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 àti 10 mg/L) àti omi tí a ti fọ̀ mọ́ ara wọn gẹ́gẹ́ bí ìdarí. Lẹ́yìn tí ohun èlò náà ti lẹ̀, a gbé ìdìpọ̀ mycelial ti Sclerotinia sclerotiorum culture, tí ó ní ìwọ̀n 4 mm ní iwọ̀n, sí àárín àwo Petri a sì gbìn ín ní 25±2°C títí tí mycelium fi bo gbogbo àwo Petri tí a ti ṣàkóso, lẹ́yìn náà ni a ṣe àkọsílẹ̀ ìdàgbàsókè olu náà. Ṣírò ìdínà ìpín ogorun ìdàgbàsókè radial ti S. sclerotiorum nípa lílo ìṣirò 1:
A tún ṣe àyẹ̀wò náà lẹ́ẹ̀mejì, pẹ̀lú àwọn àtúnṣe ẹ̀dá alààyè mẹ́fà fún ẹgbẹ́ ìṣàkóso/àyẹ̀wò kọ̀ọ̀kan àti àwọn ìkòkò márùn-ún (àwọn ewéko méjì fún ìkòkò kọ̀ọ̀kan) fún àtúnṣe ẹ̀dá alààyè kọ̀ọ̀kan. A ṣe àyẹ̀wò àtúnṣe ẹ̀dá alààyè kọ̀ọ̀kan lẹ́ẹ̀mejì (àwọn àtúnṣe ìmọ̀ ẹ̀rọ méjì) láti rí i dájú pé àwọn àbájáde àyẹ̀wò náà péye, ó ṣeé gbẹ́kẹ̀lé, àti pé ó ṣeé ṣe kí ó tún ṣe. Ní àfikún, a lo àtúnyẹ̀wò ìfàsẹ́yìn probit láti ṣírò ìfojúsùn ìdènà ìdajì (IC50) àti IC99 (Prentice, 1976).
Láti ṣe àyẹ̀wò agbára L-ornithine lábẹ́ àwọn ipò ewéko, a ṣe àwọn àyẹ̀wò ìkòkò méjì tí ó tẹ̀lé ara wọn. Ní kúkúrú, a fi ilẹ̀ amọ̀ àti iyanrìn tí a ti sọ di mímọ́ (3:1) kún àwọn ìkòkò náà, a sì fi àṣà S. sclerotiorum tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ ṣe àgbékalẹ̀ rẹ̀ sí i. Àkọ́kọ́, a gbin ìkòkò tí ó burú jùlọ ti S. sclerotiorum (isolate #3) nípa gígé sclerotium kan sí méjì, a gbé e sí orí PDA kan, a sì fi sínú ihò ní 25°C nínú òkùnkùn tí ó dúró ṣinṣin (wákàtí 24) fún ọjọ́ mẹ́rin láti mú kí ìdàgbàsókè mycelium pọ̀ sí i. Lẹ́yìn náà, a mú àwọn púlọ́ọ̀gì agar mẹ́rin tí ó ní ìwọ̀n 5 mm láti etí iwájú, a sì fi 100 g ti àdàpọ̀ àlìkámà àti ẹ̀fọ́ ìrẹsì (1:1, v/v) sí i, a sì fi gbogbo àwọn ìgò sí i ní 25 ± 2°C lábẹ́ ìmọ́lẹ̀ wákàtí 12/ìyípo òkùnkùn wákàtí 12 fún ọjọ́ márùn-ún láti mú kí ìṣẹ̀dá sclerotia pọ̀ sí i. A da gbogbo àwọn ìgò náà pọ̀ dáadáa láti rí i dájú pé wọ́n jọra kí a tó fi ilẹ̀ kún un. Lẹ́yìn náà, a fi 100 g ti adalu bran ti o n ṣe awọ ara sinu ikoko kọọkan lati rii daju pe awọn kokoro arun wa nigbagbogbo. A fun awọn ikoko ti a fi abẹ́rẹ́ fun ni omi lati mu idagbasoke olu ṣiṣẹ ati fi sinu ipo eefin fun ọjọ meje.
Lẹ́yìn náà, a gbìn irúgbìn márùn-ún ti irúgbìn Giza 3 sínú ìkòkò kọ̀ọ̀kan. Fún àwọn ìkòkò tí a fi L-ornithine àti Rizolex-T tí a fi oògùn olóró pa, a kọ́kọ́ fi àwọn irúgbìn tí a ti fi oògùn olóró pa fún wákàtí méjì nínú omi olómi ti àwọn èròjà méjì pẹ̀lú ìwọ̀n IC99 ìkẹyìn tó tó nǹkan bí 250 mg/L àti 50 mg/L, lẹ́sẹẹsẹ, lẹ́yìn náà a gbẹ wọ́n ní afẹ́fẹ́ fún wákàtí kan kí a tó gbìn wọ́n. Ní ọwọ́ kejì ẹ̀wẹ̀, a fi omi olómi olómi sí inú omi olómi gẹ́gẹ́ bí ìdènà búburú. Lẹ́yìn ọjọ́ mẹ́wàá, kí a tó fún wọn ní omi àkọ́kọ́, a ti dín àwọn irúgbìn náà kù, a sì fi àwọn irúgbìn méjì tí ó mọ́ sílẹ̀ nínú ìkòkò kọ̀ọ̀kan. Ní àfikún, láti rí i dájú pé a kó àrùn pẹ̀lú S. sclerotiorum, a gé àwọn igi ewa ní ìpele ìdàgbàsókè kan náà (ọjọ́ mẹ́wàá) ní àwọn ibi méjì ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ nípa lílo scalpel tí a ti fi oògùn olómi pa, a sì fi nǹkan bí 0.5 g ti àdàpọ̀ bran tí ó ń mú kí ara gbóná sí ọgbẹ́ kọ̀ọ̀kan, lẹ́yìn náà a fi ọ̀rinrin gíga sí i láti mú kí àkóràn àti àrùn gbilẹ̀ nínú gbogbo àwọn igi tí a ti fi oògùn olómi pa. Àwọn ilé ìtọ́jú náà farapa bákan náà, wọ́n sì fi àdàpọ̀ bran tí a kò fi ìdọ̀tí ṣe sínú ọgbẹ́ náà, wọ́n sì tọ́jú rẹ̀ lábẹ́ ọ̀rinrin gíga láti ṣe àfarawé àyíká fún ìdàgbàsókè àrùn àti láti rí i dájú pé ó wà láàrín àwọn ẹgbẹ́ ìtọ́jú náà.
Ọ̀nà ìtọ́jú: A fi omi omi L-ornithine (250 mg/l) tàbí oògùn apanilẹ́rìn-ín Rizolex-T (50 mg/l) bo àwọn irugbin ewa nípa fífún ilẹ̀ ní omi, lẹ́yìn náà a tún fi omi bo ilẹ̀ náà ní ìgbà mẹ́ta ní àárín ọjọ́ mẹ́wàá. A fi omi amúlétutù 500 milimita bo àwọn ohun èlò tí a fi placebo ṣe. A ṣe gbogbo ìtọ́jú lábẹ́ àwọn ipò ewéko (25 ± 2°C, ọriniinitutu 75 ± 1%, àti ìgbóná àárọ̀ wákàtí 8/òkùnkùn wákàtí 16). A fi omi bo gbogbo àwọn ìkòkò ní ọ̀sẹ̀ méjì, a sì fi ajile NPK tí ó wà ní ìwọ̀ntúnwọ̀nsì tọ́jú wọn lóṣooṣù (20-20-20, pẹ̀lú 3.6% sulfur àti TE microelements; Zain Seeds, Egypt) ní ìwọ̀n 3–4 g/l nípa fífún àwọn ewéko ní ìpele gẹ́gẹ́ bí àwọn àbá fún irúgbìn pàtó àti ìlànà olùpèsè ṣe. Àyàfi tí a bá sọ pé ó yàtọ̀ sí èyí, a kó àwọn ewé tó ti gbó tán pátápátá (ewé kejì àti kẹta láti òkè) láti inú gbogbo àwọn ewé onímọ̀ nípa ẹ̀dá alààyè ní wákàtí 72 lẹ́yìn ìtọ́jú (hpt), a sọ wọ́n di ọ̀kan, a kó wọn jọpọ̀, a sì tọ́jú wọn ní -80 °C fún àwọn àyẹ̀wò síwájú sí i, títí bí, ibi tí a ti ń rí i pé ó ní àmì ìdààmú oxidative, lipid peroxidation, enzymatic àti non-enzymatic antioxidants àti ìfihàn jínì.
A ṣe àyẹ̀wò bí àrùn funfun ṣe le tó ní ìwúwo lórí mílíkì funfun ní ọ̀sọ̀ọ̀sẹ̀ ọjọ́ 21 lẹ́yìn ìfúnni ní oògùn (dpi) nípa lílo ìwọ̀n 1–9 (Àtẹ S2 Àfikún) tí Teran et al. (2006) ṣe àtúnṣe sí. Ní kúkúrú, a ṣe àyẹ̀wò àwọn igi àti ẹ̀ka igi ewa láti ibi tí a ti fúnni ní oògùn láti tẹ̀lé ìlọsíwájú àwọn ọgbẹ́ ní ẹ̀gbẹ́ àwọn internodes àti àwọn nodes. A wọ́n ìjìnnà tí ọgbẹ́ náà wà láti ibi tí a ti fúnni ní oògùn sí ibi tí ó jìnnà jùlọ ní ẹ̀ka igi tàbí ẹ̀ka náà, a sì yan àmì 1–9 gẹ́gẹ́ bí ibi tí ọgbẹ́ náà wà, níbi tí (1) kò fi hàn pé kò sí àkóràn tí a lè rí nítòsí ibi tí a fúnni ní oògùn náà àti (2–9) fi hàn pé ìbísí díẹ̀díẹ̀ nínú ìwọ̀n ọgbẹ́ náà àti ìtẹ̀síwájú rẹ̀ ní ẹ̀gbẹ́ àwọn nodes/internodes (Àtẹ S2 Àfikún). A yí agbára àkóràn mílíkì funfun padà sí ìpíndọ́gba nípa lílo fọ́múlá 2:
Ní àfikún, a ṣírò agbègbè tí ó wà lábẹ́ ìlà ìlọsíwájú àrùn (AUDPC) nípa lílo fọ́múlá (Shaner àti Finney, 1977), èyí tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ ṣe àtúnṣe fún ìbàjẹ́ funfun ti ewa gbogbogbò (Chauhan et al., 2020) nípa lílo ìgbékalẹ̀ 3:
Níbi tí Yi = bí àrùn ṣe le tó ní àkókò ti, Yi+1 = bí àrùn ṣe le tó ní àkókò tí ó tẹ̀lé ti+1, ti = àkókò wíwọ̀n àkọ́kọ́ (ní ọjọ́), ti+1 = àkókò wíwọ̀n tó tẹ̀lé (ní ọjọ́), n = àpapọ̀ iye àkókò tàbí àwọn àmì àkíyèsí. Àwọn pàrámítà ìdàgbàsókè ewéko ewa pẹ̀lú gíga ewéko (cm), iye ẹ̀ka fún ewéko kọ̀ọ̀kan, àti iye ewé fún ewéko kọ̀ọ̀kan ni a kọ sílẹ̀ lọ́sọ̀ọ̀sẹ̀ fún ọjọ́ 21 nínú gbogbo àwọn àtúnṣe ẹ̀dá alààyè.
Nínú àtúnṣe ẹ̀dá alààyè kọ̀ọ̀kan, a kó àwọn àpẹẹrẹ ewé (ewé kejì àti ìkẹta tí ó ti dàgbà tán láti òkè) jọ ní ọjọ́ karùndínlọ́gọ́ta lẹ́yìn ìtọ́jú (ọjọ́ mẹ́ẹ̀ẹ́dógún lẹ́yìn ìtọ́jú ìkẹyìn). Àtúnṣe ẹ̀dá alààyè kọ̀ọ̀kan ní ìkòkò márùn-ún (ewé méjì fún ìkòkò kọ̀ọ̀kan). Nǹkan bí 500 miligiramu ti àsopọ tí a fọ́ ni a lò fún yíyọ àwọn àwọ̀ photosynthetic (chlorophyll a, chlorophyll b àti carotenoids) nípa lílo 80% acetone ní 4 °C nínú òkùnkùn. Lẹ́yìn wákàtí mẹ́rìnlélógún, a fi centrifuge àwọn àpẹẹrẹ náà, a sì kó àwọ̀ ara rẹ̀ jọ láti pinnu àwọn akoonu chlorophyll a, chlorophyll b àti carotenoid nípa lílo spectrophotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan) gẹ́gẹ́ bí ọ̀nà (Lichtenthaler, 1987) nípa wíwọ̀n ìfàmọ́ra ní àwọn ìgbì omi mẹ́ta tí ó yàtọ̀ síra (A470, A646 àti A663 nm). Níkẹyìn, a ṣírò àkóónú àwọn àwọ̀ photosynthetic nípa lílo àwọn fọ́múlá 4–6 tí Lichtenthaler (1987) ṣàpèjúwe.
Ní wákàtí 72 lẹ́yìn ìtọ́jú (hpt), a kó àwọn ewé (ewé kejì àti ìkẹta tí ó ti dàgbà tán láti òkè) láti inú àtúnṣe ẹ̀dá alààyè kọ̀ọ̀kan fún ìbílẹ̀ hydrogen peroxide (H2O2) àti superoxide anion (O2•−). Àtúnṣe ẹ̀dá alààyè kọ̀ọ̀kan ní ìkòkò márùn-ún (ewéko méjì fún ìkòkò kọ̀ọ̀kan). A ṣe àyẹ̀wò àtúnṣe ẹ̀dá alààyè kọ̀ọ̀kan ní àtúnṣe ẹ̀dá (àtúnṣe ìmọ̀ ẹ̀rọ méjì) láti rí i dájú pé ọ̀nà náà péye, ó ṣeé gbẹ́kẹ̀lé àti pé ó ṣeé ṣe láti tún un ṣe. A pinnu H2O2 àti O2•− nípa lílo 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) tàbí nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany), ní ìtẹ̀léra, ní títẹ̀lé àwọn ọ̀nà tí Romero-Puertas et al. (2004) àti Adam et al. (1989) ṣàpèjúwe pẹ̀lú àwọn àtúnṣe díẹ̀. Fún ìbímọ H2O2 ní ibi tí ó wà nínú histochemical, a fi 0.1% DAB sínú vacuum nínú 10 mM Tris buffer (pH 7.8) lẹ́yìn náà a fi sínú vacuum ní iwọ̀n otútù yàrá nínú ìmọ́lẹ̀ fún ìṣẹ́jú 60. A fi 0.15% (v/v) TCA sínú ethanol:chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) sínú àwọn ìwé kékeré náà, a sì fi sí ìmọ́lẹ̀ títí tí wọ́n fi ṣókùnkùn. Bákan náà, a fi 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.8) sínú vacuum pẹ̀lú 0.1 w/v % HBT fún ìbímọ histochemical ti O2•− ní ibi tí ó wà nínú histochemical. A fi 0.1% DAB sínú iná ní iwọ̀n otútù yàrá fún ìṣẹ́jú 20, lẹ́yìn náà a fi 0.20 ... A ṣe àyẹ̀wò bí àwọ̀ brown tó jáde (gẹ́gẹ́ bí àmì H2O2) tàbí àwọ̀ bulu-violet (gẹ́gẹ́ bí àmì O2•−) ṣe le tó nípa lílo ẹ̀yà Fiji ti àpò ìṣiṣẹ́ àwòrán ImageJ (http://fiji.sc; a wọlé sí ní ọjọ́ keje oṣù kẹta ọdún 2024).
A pinnu Malondialdehyde (MDA; gẹ́gẹ́ bí àmì lípídéréètì peroxidation) gẹ́gẹ́ bí ọ̀nà Du àti Bramlage (1992) pẹ̀lú àwọn àtúnṣe díẹ̀. A kó àwọn ewé láti inú àtúnṣe ẹ̀dá alààyè kọ̀ọ̀kan (ewé kejì àti ìkẹta tí ó ti dàgbà tán láti òkè) jọ fún wákàtí 72 lẹ́yìn ìtọ́jú (hpt). Àtúnṣe ẹ̀dá alààyè kọ̀ọ̀kan ní ìkòkò márùn-ún (ewé méjì fún ìkòkò kọ̀ọ̀kan). A ṣe àyẹ̀wò àtúnṣe ẹ̀dá alààyè kọ̀ọ̀kan ní ẹ̀dà méjì (àwọn àtúnṣe ìmọ̀ ẹ̀rọ méjì) láti rí i dájú pé ọ̀nà náà péye, ó ṣeé gbẹ́kẹ̀lé àti pé ó ṣeé ṣe láti tún un ṣe. Ní kúkúrú, a lo 0.5 g ti àsopọ ewé ilẹ̀ fún yíyọ MDA pẹ̀lú 20% trichloroacetic acid (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) tí ó ní 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Lẹ́yìn náà, a pinnu àkóónú MDA nínú supernatant ní àwọ̀ nípa wíwọ̀n ìfàmọ́ra ní 532 àti 600 nm nípa lílo UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) lẹ́yìn náà a sì sọ ọ́ di nmol g−1 FW.
Fún ìṣàyẹ̀wò àwọn antioxidants tí kìí ṣe enzymatic àti enzymatic, a kó àwọn ewé (ewé kejì àti kẹta tí ó ti dàgbà tán láti òkè) láti inú àdàkọ ẹ̀dá alààyè kọ̀ọ̀kan ní wákàtí 72 lẹ́yìn ìtọ́jú (hpt). Àdàkọ ẹ̀dá alààyè kọ̀ọ̀kan ní ìkòkò márùn-ún (ewé méjì fún ìkòkò kọ̀ọ̀kan). A ṣe àyẹ̀wò àyẹ̀wò ẹ̀dá alààyè kọ̀ọ̀kan ní ìdàpọ̀ méjì (àyẹ̀wò ìmọ̀ ẹ̀rọ méjì). A fi nitrogen omi lọ̀ ewé méjì, a sì lò ó tààrà fún ìpinnu àwọn antioxidants enzymatic àti non-enzymatic, gbogbo amino acids, àkóónú proline, ìfarahàn jínì, àti ìṣàfihàn oxalate.
A pinnu gbogbo awọn phenolic ti o le yo nipa lilo reagent Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pẹlu awọn iyipada diẹ ti ọna ti Kahkonen et al. (1999) ṣalaye. Ni ṣoki, a fa to 0.1 g ti àsopọ ewe homogenized jade pẹlu 20 milimita 80% methanol ninu okunkun fun wakati 24 ati pe a gba supernatant lẹhin centrifugation. A da 0.1 milimita ti ayẹwo ti a yọ jade pẹlu reagent Folin-Ciocalteu 0.5 milimita (10%), a gbọn fun iṣẹju 30 a si fi silẹ ninu okunkun fun iṣẹju 5. Lẹhinna a fi 0.5 milimita ti ojutu sodium carbonate 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) kun si tube kọọkan, a dapọ daradara a si fi sinu ina ni iwọn otutu yara ni okunkun fun wakati 1. Lẹ́yìn ìfàsẹ́yìn, a wọn ìfàsẹ́yìn àdàpọ̀ ìṣesí náà ní 765 nm nípa lílo spectrophotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan). A pinnu ìṣọ̀kan gbogbo àwọn phenol tí ó lè yọ́ nínú àwọn àyẹ̀wò náà nípa lílo ìlà ìṣàtúnṣe gallic acid (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) a sì sọ ọ́ gẹ́gẹ́ bí milligrams ti gallic acid tó dọ́gba fún giramu ti ìwọ̀n tuntun (mg GAE g-1 ìwọ̀n tuntun).
A pinnu iye flavonoid ti o le yo ni ibamu si ọna Djeridane et al. (2006) pẹlu awọn iyipada diẹ. Ni ṣoki, a da 0.3 milimita ti iyọkuro methanol ti o wa loke pọ mọ 0.3 milimita ti ojutu aluminiomu kiloraidi 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), a ru pẹlu agbara ati lẹhinna a fi sinu ina ni iwọn otutu yara fun iṣẹju 5, lẹhin naa a fi 0.3 milimita ti ojutu potasiomu acetate 10% kun (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), a dapọ daradara ati a fi sinu ina ni iwọn otutu yara fun iṣẹju 30 ni dudu. Lẹhin incubation, a wọn gbigba ti adalu reaction ni 430 nm nipa lilo UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). A pinnu ifọkansi ti awọn flavonoids ti o le yo ni awọn ayẹwo awọn iyọkuro nipa lilo iṣiro rutin (TCI America, Portland, OR, USA) lẹhinna a fihan bi awọn miligiramu ti deede rutin fun giramu ti iwuwo tuntun (mg RE g-1 iwuwo tuntun).
A pinnu iye amino acid ọfẹ ti awọn ewe ewa ni lilo reagent ninhydrin ti a ti yipada (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ti a da lori ọna ti Yokoyama ati Hiramatsu (2003) dabaa ati Sun et al. (2006) ti ṣe atunṣe. Ni kukuru, a yọ 0.1 g ti àsopọ ilẹ pẹlu pH 5.4 buffer, ati 200 μL ti supernatant ni a ṣe atunṣe pẹlu 200 μL ti ninhydrin (2%) ati 200 μL ti pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), ti a fi sinu omi gbigbona fun iṣẹju 30, lẹhinna tutu ati wọn ni 580 nm nipa lilo spectrophotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan). Ni apa keji, a pinnu proline nipasẹ ọna Bates (Bates et al., 1973). Wọ́n yọ Proline kúrò pẹ̀lú 3% sulfosalicylic acid (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) lẹ́yìn tí wọ́n ti yọ centrifugation, wọ́n da 0.5 milimita ti supernatant pọ̀ mọ́ 1 milimita glacial acetic acid (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) àti ninhydrin reagent, wọ́n fi sínú 90°C fún ìṣẹ́jú 45, wọ́n tutù wọ́n sì wọn ní 520 nm nípa lílo spectrophotometer kan náà gẹ́gẹ́ bí a ti sọ lókè yìí. A pinnu gbogbo amino acids àti proline tí kò ní ìwé nínú àwọn ìyọkúrò ewé nípa lílo àwọn ìlà ìṣàtúnṣe glycine àti proline (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), lẹ́sẹẹsẹ, wọ́n sì sọ wọ́n di mg/g ìwọ̀n tuntun.
Láti mọ bí enzymatic ṣe ń ṣiṣẹ́ àwọn enzymu antioxidant, a fa nǹkan bí 500 miligiramu ti àsopọ homogenized jáde pẹ̀lú 3 milimita ti 50 mM Tris buffer (pH 7.8) tí ó ní 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) àti 7.5% polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), tí a fi centrifuge ṣe ní 10,000 × g fún ìṣẹ́jú 20 lábẹ́ fìríìjì (4 °C), a sì kó supernatant (ìyọkúrò enzyme rọ̀bì) jọ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Lẹ́yìn náà, wọ́n ṣe àtúnṣe sí Catalase (CAT) pẹ̀lú 2 milimita ti 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) àti 100 μl ti 269 mM H2O2 ojutu lati pinnu iṣẹ enzymatic rẹ gẹgẹbi ọna Aebi (1984) pẹlu awọn iyipada diẹ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). A pinnu iṣẹ enzymatic peroxidase (POX) ti Guaiacol-dependent (POX) nipa lilo ọna Harrach et al. (2009). (2008) pẹ̀lú àwọn àtúnṣe díẹ̀ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) àti ìṣiṣẹ́ enzymatic ti polyphenol oxidase (PPO) ni a pinnu lẹ́yìn ìhùwàpadà pẹ̀lú 2.2 milimita ti 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), 100 μl ti guaiacol (TCI kemika, Portland, OR, USA) àti 100 μl ti 12 mM H2O2. Ọ̀nà náà ni a yípadà díẹ̀ láti (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). A ṣe ìwádìí náà lẹ́yìn ìhùwàpadà pẹ̀lú 3 milimita ti omi catechol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) tí a ṣe tuntun nínú 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0). A wọn ìgbòkègbodò CAT nípa ṣíṣàyẹ̀wò ìbàjẹ́ H2O2 ní 240 nm (A240), a wọn ìgbòkègbodò POX nípa ṣíṣàyẹ̀wò ìbísí nínú ìfàmọ́ra ní 436 nm (A436), a sì wọn ìgbòkègbodò PPO nípa ṣíṣàkọsílẹ̀ ìyípadà ìfàmọ́ra ní 495 nm (A495) ní gbogbo ìṣẹ́jú àáyá 3 fún ìṣẹ́jú 3 nípa lílo spectrophotometer UV-160A (Shimadzu, Japan).
A lo RT-PCR gidi-akoko lati ṣawari ipele igbasilẹ ti awọn jiini mẹta ti o ni ibatan si antioxidant, pẹlu peroxisomal catalase (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), ati glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), ninu awọn ewe ewa (awọn ewe keji ati kẹta ti o dagbasoke patapata lati oke) ni wakati 72 lẹhin itọju ikẹhin. Ni kukuru, a ya RNA kuro nipa lilo Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) gẹgẹbi ilana olupese. Lẹhinna, a ṣe iṣelọpọ cDNA nipa lilo TOP script™ cDNA Synthesis Kit gẹgẹbi awọn ilana olupese. Awọn atẹle akọkọ ti awọn jiini mẹta ti o wa loke ni a ṣe akojọ ninu Tabili Afikun S3. A lo PvActin-3 (Nọ́mbà ìfàsẹ́yìn GenBank: XM_068616709.1) gẹ́gẹ́ bí ìtọ́jú ilé, a sì ṣírò ìfarahàn ìfarahàn ìfarahàn ìfarahàn ìfarahàn ìfarahàn ìfarahàn nípa lílo ọ̀nà 2-ΔΔCT (Livak àti Schmittgen, 2001). Ìdúróṣinṣin Actin lábẹ́ ìdààmú biotic (ìbáṣepọ̀ tí kò báramu láàárín àwọn ewéko tí a sábà máa ń lò àti ewéko anthracnose Colletotrichum lindemuthianum) àti ìdààmú abiotic (ọ̀gbẹ, iyọ̀, iwọ̀n otútù kékeré) ni a fihàn (Borges et al., 2012).
Ní àkọ́kọ́, a ṣe àgbéyẹ̀wò jínómù-gbogbo nínú ìwádìí sílíkò ti àwọn prótíìnì oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) nínú S. sclerotiorum nípa lílo ohun èlò BLAST protein-protein (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Ní ​​kúkúrú, a lo OAH láti Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; nọ́mbà accession GenBank XP_040799428.1; amino acids 342) àti Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; nọ́mbà accession GenBank XP_056833920.1; amino acids 316) gẹ́gẹ́ bí ìtẹ̀lé ìbéèrè láti ṣe àfihàn prótíìnì homologous nínú S. sclerotiorum (taxide: 5180). A ṣe BLASTp pẹ̀lú ìwádìí genome S. sclerotiorum tó ṣẹ̀ṣẹ̀ wà ní GenBank lórí ojú-òpó wẹ́ẹ̀bù National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Ní àfikún, a ṣe àyẹ̀wò jínì OAH tí a sọ tẹ́lẹ̀ láti inú S. sclerotiorum (SsOAH) àti ìwádìí ìyípadà àti igi phylogenetic ti AfOAH láti inú A. fijiensis CBS 313.89 àti PlOAH láti inú P. lagena nípa lílo ọ̀nà ìṣeéṣe tó pọ̀ jùlọ nínú MEGA11 (Tamura et al., 2021) àti àwòṣe JTT matrix-based (Jones et al., 1992). A so igi phylogenetic pọ̀ mọ́ ìwádìí ìṣètò púp ... Ní àfikún, àwọn ìtẹ̀léra amino acid tó báramu tó dára jùlọ ti SsOAH láti S. sclerotiorum ni a ṣe ìbáramu pẹ̀lú àwọn ìtẹ̀léra ìbéèrè (AfOAH àti PlOAH) (Larkin et al., 2007) nípa lílo ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), a sì fi ojú inú wo àwọn agbègbè tí a ti tọ́jú nínú ìtòlẹ́sẹẹsẹ náà nípa lílo irinṣẹ́ ESPript (ẹ̀yà 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Síwájú sí i, àwọn agbègbè aṣojú iṣẹ́ tí a sọ tẹ́lẹ̀ àti àwọn ibi tí a ti tọ́jú ti S. sclerotiorum SsOAH ni a pín sí oríṣiríṣi ìdílé nípa lílo ohun èlò InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Níkẹyìn, a ṣe àwòṣe ìṣètò onípele mẹ́ta (3D) ti S. sclerotiorum SsOAH tí a sọ tẹ́lẹ̀ nípa lílo Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) a sì fi ẹ̀tọ́ sí i nípa lílo server SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). A fi àwọn ètò onípele mẹ́ta tí a sọ tẹ́lẹ̀ (ìrísí PDB) hàn nípa lílo àpò UCSF-Chimera (ẹ̀yà 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
A lo PCR fluorescence gidi-time lati pinnu ipele transcription ti oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; nọmba accession GenBank: XM_001590428.1) ninu mycelia ti Sclerotinia sclerotiorum. Ni kukuru, a fi S. sclerotiorum sinu ago kan ti o ni PDB a si fi sinu incubator ti n gbọn (awoṣe: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ni 25 ± 2 °C fun wakati 24 ni 150 rpm ati ninu okunkun nigbagbogbo (wakati 24) lati mu idagbasoke mycelium pọ si. Lẹhin naa, a fi L-ornithine ati fungicide Rizolex-T tọju awọn sẹẹli naa ni awọn ifọkansi IC50 ikẹhin (to iwọn 40 ati 3.2 mg/L, lẹsẹsẹ) lẹhinna a gbin wọn fun wakati 24 miiran labẹ awọn ipo kanna. Lẹ́yìn ìfàsẹ́yìn, a fi centrifuge àwọn àgbẹ̀ náà síta ní 2500 rpm fún ìṣẹ́jú 5, a sì kó àwọn ohun tí ó wà ní òkèèrè (mycelium fungal) jọ fún ìṣàyẹ̀wò ìfarahàn jínì. Bákan náà, a kó mycelium fungal ní wákàtí 0, 24, 48, 72, 96, àti 120 lẹ́yìn àkóràn láti inú àwọn ewéko tí ó ní àkóràn tí wọ́n ti ṣe àwọ̀ funfun àti mycelium owu lórí ojú àwọn àsopọ tí ó ní àkóràn náà. A yọ RNA kúrò nínú mycelium fungal náà, lẹ́yìn náà a ṣe àgbékalẹ̀ cDNA gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ lókè. Àwọn ìtẹ̀léra àkọ́kọ́ fún SsOAH ni a kọ sílẹ̀ nínú Àtẹ Àfikún S3. A lo SsActin (Nọ́mbà ìfàsẹ́yìn GenBank: XM_001589919.1) gẹ́gẹ́ bí jínì tí ń tọ́jú ilé, a sì ṣírò ìfarahàn jínì tí ó ní ìbátan nípa lílo ọ̀nà 2-ΔΔCT (Livak àti Schmittgen, 2001).
A pinnu oxalic acid ninu omi ọbẹ̀ ọdunkun dextrose (PDB) ati awọn ayẹwo ọgbin ti o ni kokoro arun olu Sclerotinia sclerotiorum gẹgẹbi ọna Xu ati Zhang (2000) pẹlu awọn iyipada diẹ. Ni ṣoki, a fi awọn iyọkuro S. sclerotiorum sinu awọn agolo ti o ni PDB lẹhinna a gbin wọn sinu incubator gbigbọn (awoṣe I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ni 150 rpm ni 25 ± 2 °C fun ọjọ 3–5 ninu okunkun igbagbogbo (wakati 24) lati mu idagbasoke mycelium pọ si. Lẹhin incubation, a kọkọ yọ aṣa olu naa nipasẹ iwe àlẹmọ Whatman #1 lẹhinna a fi centrifuge si ni 2500 rpm fun iṣẹju 5 lati yọ mycelium ti o ku kuro. A gba supernatant naa a si tọju rẹ ni 4°C fun ipinnu iye oxalate siwaju sii. Fun igbaradi awọn ayẹwo ọgbin, a fa to 0.1 g ti awọn ege ti ara ọgbin jade ni igba mẹta pẹlu omi ti a ti yọ (2 milimita ni akoko kọọkan). Lẹ́yìn náà, wọ́n fi centrifuge sí àwọn àpẹẹrẹ náà ní 2500 rpm fún ìṣẹ́jú márùn-ún, wọ́n sì fi àwọ̀ omi gbígbẹ yọ́ ọ́n sínú ìwé àlẹ̀mọ́ Whatman No. 1, wọ́n sì kó wọn jọ fún ìwádìí síwájú sí i.
Fún ìṣàyẹ̀wò iye oxalic acid, a ṣe àdàpọ̀ ìṣiṣẹ́ náà nínú páìpù dídì tí a fi gilasi ṣe ní ìtòlẹ́sẹẹsẹ wọ̀nyí: 0.2 milimita ti àyẹ̀wò (tàbí PDB culture filtrate tàbí oxalic acid standard solution), 0.11 milimita ti bromophenol blue (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0.198 milimita ti 1 M sulfuric acid (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) àti 0.176 milimita ti 100 mM potassium dichromate (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), lẹ́yìn náà a fi omi dídì pò omi náà sí 4.8 milimita, a dà á pọ̀ dáadáa, a sì fi sínú omi ìwẹ̀ 60 °C lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀. Lẹ́yìn ìṣẹ́jú 10, a dá ìṣiṣẹ́ náà dúró nípa fífi 0.5 milimita ti sodium hydroxide solution (NaOH; 0.75 M) kún un. A wọn ìfàmọ́ra (A600) ti adalu ìṣesí náà ní 600 nm nípa lílo ohun èlò UV-160 spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). A lo PDB àti omi tí a ti yọ kúrò gẹ́gẹ́ bí ìṣàkóso fún ìwọ̀n àwọn àlẹ̀mọ́ àṣà àti àwọn àpẹẹrẹ ohun ọ̀gbìn, lẹ́sẹẹsẹ. Àwọn ìpele oxalic acid nínú àwọn àlẹ̀mọ́ àṣà, tí a sọ gẹ́gẹ́ bí micrograms ti oxalic acid fún millilita kan ti alabọde PDB (μg.mL−1), àti nínú àwọn èwé tí a sọ gẹ́gẹ́ bí micrograms ti oxalic acid fún giramu ti ìwọ̀n tuntun (μg.g−1 FW), ni a pinnu nípa lílo ìlà ìṣàtúnṣe oxalic acid (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Jálẹ̀ ìwádìí náà, gbogbo àwọn àdánwò ni a ṣe ní apẹrẹ tí a kò lè fojú rí (CRD) pẹ̀lú àwọn àdánwò ẹ̀dá alààyè mẹ́fà fún ìtọ́jú kan àti àwọn ìkòkò márùn-ún fún àdánwò ẹ̀dá alààyè (àwọn ewéko méjì fún ìkòkò kan) àyàfi tí a bá sọ pé ó yàtọ̀. A ṣe àyẹ̀wò àwọn àdánwò ẹ̀dá alààyè ní ẹ̀dà méjì (àwọn àdánwò ìmọ̀ ẹ̀rọ méjì). A lo àwọn àdánwò ìmọ̀ ẹ̀rọ láti ṣàyẹ̀wò bí àdánwò kan náà ṣe lè tún ṣe, ṣùgbọ́n a kò lò wọ́n nínú àdánwò ìṣirò láti yẹra fún àwọn àdánwò èké. A ṣe àyẹ̀wò àwọn ìwádìí ìṣirò nípa lílo àyẹ̀wò ìyàtọ̀ (ANOVA) lẹ́yìn náà, a sì ṣe àyẹ̀wò Tukey-Kramer ní òótọ́ ní ìyàtọ̀ pàtàkì (HSD) (p ≤ 0.05). Fún àwọn àdánwò nínú vitro, a ṣe ìṣirò àwọn iye IC50 àti IC99 nípa lílo àwòṣe probit àti a ṣírò àwọn àlàfo ìgbẹ́kẹ̀lé 95%.
Àròpọ̀ àwọn ohun ọ̀gbìn mẹ́rin ni a kó jọ láti oríṣiríṣi oko soybean ní Ìpínlẹ̀ El Ghabiya, Íjíbítì. Lórí àwo PDA, gbogbo àwọn ohun ọ̀gbìn náà mú mycelium funfun onípara jáde tí ó yára di funfun bíi owu (Àwòrán 1A) lẹ́yìn náà ó di beige tàbí brown ní ìpele sclerotium. Sclerotia sábà máa ń nípọn, dúdú, onígun mẹ́rẹ̀ẹ̀rin tàbí aláìdọ́gba ní ìrísí, 5.2 sí 7.7 mm gígùn àti 3.4 sí 5.3 mm ní ìwọ̀n iwọ̀n (Àwòrán 1B). Bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn ohun ọ̀gbìn mẹ́rin ní ìrísí sclerotia ní etí àwo ọ̀gbìn lẹ́yìn ọjọ́ 10–12 tí a fi gún un ní 25 ± 2 °C (Àwòrán 1A), iye sclerotia fún àwo kọ̀ọ̀kan yàtọ̀ síra gidigidi láàárín wọn (P < 0.001), pẹ̀lú ìrísí 3 tí ó ní iye sclerotia tí ó ga jùlọ (32.33 ± 1.53 sclerotia fún àwo kọ̀ọ̀kan; Àwòrán 1C). Bákan náà, isolate #3 ṣe àgbékalẹ̀ oxalic acid púpọ̀ sí i nínú PDB ju àwọn isolate mìíràn lọ (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Àwòrán 1D). Isolate #3 fi àwọn ànímọ́ ìrísí àti ohun tí kò ṣe kedere ti fungus phytopathogenic Sclerotinia sclerotiorum hàn. Fún àpẹẹrẹ, lórí PDA, àwọn colonies ti isolate #3 dàgbàsókè kíákíá, wọ́n jẹ́ funfun onípara (Àwòrán 1A), beige tàbí ẹja salmon aláwọ̀ ewé, wọ́n sì nílò ọjọ́ 6-7 ní 25 ± 2°C láti bo ojú àwo oníwọ̀n 9 cm pátápátá. Gẹ́gẹ́ bí àwọn ànímọ́ ìrísí àti ohun tí kò ṣe kedere tí a mẹ́nu kàn lókè yìí, a dá isolate #3 mọ̀ gẹ́gẹ́ bí Sclerotinia sclerotiorum.
Àwòrán 1. Àwọn ànímọ́ àti ìpalára àrùn àwọn ìyàtọ̀ S. sclerotiorum láti inú àwọn irugbin ègé tí a sábà máa ń gbìn. (A) Ìdàgbàsókè Mycelial ti àwọn ìyàtọ̀ S. sclerotiorum mẹ́rin lórí àárín PDA, (B) sclerotia ti àwọn ìyàtọ̀ S. sclerotiorum mẹ́rin, (C) iye sclerotia (fún àwo kọ̀ọ̀kan), (D) ìtújáde oxalic acid lórí àárín PDB (μg.mL−1), àti (E) bí àrùn ṣe le tó (%) ti àwọn ìyàtọ̀ S. sclerotiorum mẹ́rin lórí irúgbìn ègé tí a lè rà tí ó lè rà tí ó jẹ́ Giza 3 lábẹ́ àwọn ipò ewéko. Àwọn ìwọ̀n dúró fún àròpín ± SD ti àwọn ìyípadà ẹ̀dá márùn-ún (n = 5). Àwọn lẹ́tà ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ fi ìyàtọ̀ pàtàkì hàn láàrín àwọn ìtọ́jú (p < 0.05). (F–H) Àwọn àmì àrùn funfun tí ó wọ́pọ̀ farahàn lórí àwọn igi àti àwọn sílíkúùkù tí ó wà lókè ilẹ̀, ní ọjọ́ mẹ́wàá lẹ́yìn ìfúnni ní iyọ̀ pẹ̀lú ìyàtọ̀ #3 (dpi). (I) A ṣe àgbéyẹ̀wò ìdàgbàsókè ti agbègbè spacer inú (ITS) ti S. sclerotiorum isolate #3 nípa lílo ọ̀nà ìṣeéṣe tó ga jùlọ, a sì fi wéra pẹ̀lú àwọn ìyàsọ́tọ̀ ìtọ́kasí 20 tí a rí láti inú ibi ìpamọ́ data National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Àwọn nọ́mbà tí ó wà lókè àwọn ìlà ìṣọ̀kan fi agbègbè náà hàn (%), àti àwọn nọ́mbà tí ó wà ní ìsàlẹ̀ àwọn ìlà ìṣọ̀kan fi gígùn ẹ̀ka náà hàn.
Síwájú sí i, láti fìdí àrùn náà múlẹ̀, a lo àwọn ìpín mẹ́rin tí a rí láti fi fún irúgbìn ewa tí ó lè farapa ní Giza 3 lábẹ́ àwọn ipò ewéko, èyí tí ó bá àwọn ìlànà Koch mu (Àwòrán 1E). Bó tilẹ̀ jẹ́ pé gbogbo ìpín méjì tí a rí jẹ́ àrùn tí ó lè fa àrùn, wọ́n sì lè kó àrùn náà ran ewa aláwọ̀ ewé (cv. Giza 3), èyí tí ó lè fa àwọn àmì àrùn funfun tí ó wọ́pọ̀ ní gbogbo àwọn apá tí ó wà lókè ilẹ̀ (Àwòrán 1F), pàápàá jùlọ lórí igi (Àwòrán 1G) àti àwọn èèpo (Àwòrán 1H) ní ọjọ́ mẹ́wàá lẹ́yìn ìfúnni ní oògùn (dpi), ìpín méjì ni ìpín méjì tí ó lágbára jùlọ nínú àwọn àyẹ̀wò aláìdámọ̀ méjì. Ìsọ̀ 3 ní àrùn tí ó ga jùlọ (%) lórí àwọn ewa (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, àti 76.7 ± 3.1 ní ọjọ́ 7, 14, àti ọjọ́ 21 lẹ́yìn àkóràn, lẹ́sẹẹsẹ; Àwòrán 1F).
A tún fi ìdí ìdámọ̀ S. sclerotiorum isolate #3 tó wọ́pọ̀ jùlọ múlẹ̀ nípa lílo ìtẹ̀léra spacer (ITS) (Àwòrán 1I). Ìwádìí phylogenetic láàrín àwọn isolate/ìrísí ìtọ́kasí isolate #3 àti 20 fi hàn pé wọ́n jọra gan-an (>99%) láàárín wọn. Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé S. sclerotiorum isolate #3 (533 bp) ní ìbáramu gíga pẹ̀lú American S. sclerotiorum isolate LPM36 tí a yà sọ́tọ̀ kúrò nínú èso igi gbígbẹ (Nọ́mbà ìtẹ̀lé GenBank MK896659.1; 540 bp) àti Chinese S. sclerotiorum isolate YKY211 (Nọ́mbà ìtẹ̀lé GenBank OR206374.1; 548 bp), èyí tí ó ń fa ìjẹrà igi violet (Matthiola incana), gbogbo èyí tí a kó jọ sí orí dendrogram (Àwòrán 1I). A ti fi ìtẹ̀lé tuntun náà sí ibi ìkópamọ́ NCBI tí a sì pè é ní “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (Nọ́mbà ìfàmọ́ra GenBank PV202792). A lè rí i pé isolate 3 ni isolate tó ń kó ìpalára jù; nítorí náà, a yan isolate yìí fún ìkẹ́kọ̀ọ́ nínú gbogbo àwọn ìwádìí tó tẹ̀lé e.
A ṣe ìwádìí lórí ìṣiṣẹ́ àwọn bakitéríà ti diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) ní onírúurú ìwọ̀n (12.5, 25, 50, 75, 100 àti 125 mg/L) lòdì sí S. sclerotiorum isolate 3 nínú vitro. Ó ṣe pàtàkì pé L-ornithine ní ipa antibacterial ó sì dín ìdàgbàsókè radial ti S. sclerotiorum hyphae kù díẹ̀díẹ̀ ní ọ̀nà tí ó sinmi lórí ìwọ̀n (Àwòrán 2A, B). Ní ​​ìwọ̀n gíga jùlọ tí a dán wò (125 mg/L), L-ornithine fi ìwọ̀n ìdíwọ́ ìdàgbàsókè mycelium tí ó ga jùlọ hàn (99.62 ± 0.27%; Àwòrán 2B), èyí tí ó dọ́gba pẹ̀lú Rizolex-T fungicide tí a tà (ìwọ̀n ìdíwọ́ 99.45 ± 0.39%; Àwòrán 2C) ní ìwọ̀n gíga jùlọ tí a dán wò (10 mg/L), èyí tí ó fi hàn pé ó ṣiṣẹ́ dáadáa.
Àwòrán 2. Iṣẹ́ ìpalára bakitéríà L-ornithine nínú àyẹ̀wò ara lóri Sclerotinia sclerotiorum. (A) Ìfiwéra iṣẹ́ ìpalára bakitéríà ti onírúurú ìfojúsùn L-ornithine sí S. sclerotiorum pẹ̀lú Rizolex-T fún ìpalára ajakalẹ̀-òwò (10 mg/L). (B, C) Ìwọ̀n ìdíwọ́ (%) ti ìdàgbàsókè mycelium S. sclerotiorum lẹ́yìn ìtọ́jú pẹ̀lú onírúurú ìfojúsùn L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 àti 125 mg/L) tàbí Rizolex-T (2, 4, 6, 8 àti 10 mg/L), lẹ́sẹẹsẹ. Àwọn ìwọ̀n dúró fún àròpín ± SD ti àwọn ìṣàtúnṣe ẹ̀dá márùn-ún (n = 5). Àwọn lẹ́tà ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ fi ìyàtọ̀ ìṣirò hàn láàrín àwọn ìtọ́jú (p < 0.05). (D, E) Ìṣàyẹ̀wò ìfàsẹ́yìn àwòṣe Probit ti L-ornithine àti fún ìpalára ajakalẹ̀-òwò Rizolex-T, lẹ́sẹẹsẹ. A fi ìlà ìfàsẹ́yìn àwòṣe probit hàn gẹ́gẹ́ bí ìlà aláwọ̀ búlúù tó lágbára, a sì fi àlàfo ìgbẹ́kẹ̀lé (95%) hàn gẹ́gẹ́ bí ìlà pupa onígun mẹ́ta.
Ní àfikún, a ṣe àgbéyẹ̀wò ìfàsẹ́yìn probit àti àwọn àwòrán tó báramu ni a fi hàn nínú Táblì 1 àti Àwòrán 2D,E. Ní ṣókí, iye ìsàlẹ̀ tí a gbà (y = 2.92x − 4.67) àti àwọn statistiki pàtàkì tí ó sopọ̀ mọ́ ọn (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 àti p < 0.0001; Àwòrán 2D) ti L-ornithine fi hàn pé iṣẹ́ antifungal ti pọ̀ sí i lòdì sí S. sclerotiorum ní ìfiwéra pẹ̀lú precipital fungicide Rizolex-T tí a ń tà (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 àti p < 0.0001) (Táblì 1).
Táblì 1. Àwọn iye ìfojúsùn ìdènà ààbọ̀ (IC50) àti IC99 (mg/l) ti L-ornithine àti oògùn apanirun tí a ń tà “Rizolex-T” sí S. sclerotiorum.
Ni gbogbogbo, L-ornithine (250 mg/L) dinku idagbasoke ati bi o ti wuwo ti mílí funfun lori awọn irugbin ewa ti a ti tọ́jú ni pataki ni akawe pẹlu awọn eweko ti o ni àkóràn S. sclerotiorum ti a ko tọ́jú (iṣakoso; Aworan 3A). Ni ṣoki, botilẹjẹpe bi o ti wuwo ti awọn eweko iṣakoso ti ko ni tọ́jú ti a ko tọ́jú ṣe pọ si diẹdiẹ (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, ati 92.33 ± 3.06%), L-ornithine dinku bi o ti wuwo ti aisan naa (%) ni pataki jakejado idanwo naa (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, ati 26.36 ± 3.07) ni ọjọ 7, 14, ati 21 lẹhin itọju (dpt), lẹsẹsẹ (Aworan 3A). Bákan náà, nígbà tí a fi 250 mg/L L-ornithine tọ́jú àwọn ewéko ewéko tí àrùn S. sclerotiorum ti kó ní àrùn náà, agbègbè tí ó wà lábẹ́ ìlà ìlọsíwájú àrùn náà (AUDPC) dínkù láti 1274.33 ± 33.13 nínú ìtọ́jú tí a kò tọ́jú sí 281.03 ± 7.95, èyí tí ó kéré díẹ̀ ju ti ìtọ́jú rere 50 mg/L Rizolex-T fungicide (183.61 ± 7.71; Àwòrán 3B). A rí irú ìṣẹ̀lẹ̀ kan náà nínú ìwádìí kejì.
Àwòrán 3. Àkóbá tí lílo L-ornithine láti inú ìṣẹ̀dá ìbàjẹ́ funfun ti ewa tí Sclerotinia sclerotiorum fà lábẹ́ àwọn ipò ewéko. (A) Ìtẹ̀síwájú àrùn ti ewa funfun lẹ́yìn ìtọ́jú pẹ̀lú 250 mg/L L-ornithine. (B) Agbègbè lábẹ́ ìlà ìtẹ̀síwájú àrùn (AUDPC) ti ewa funfun lẹ́yìn ìtọ́jú pẹ̀lú L-ornithine. Àwọn ìwọ̀n dúró fún àròpín ± SD ti àwọn ìyípadà ẹ̀dá alààyè márùn-ún (n = 5). Àwọn lẹ́tà ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ fi ìyàtọ̀ pàtàkì hàn láàárín àwọn ìtọ́jú (p < 0.05).
Lílo 250 mg/L L-ornithine láti ara rẹ̀ ló mú kí gíga ewéko pọ̀ sí i díẹ̀díẹ̀ (Àwòrán 4A), iye ẹ̀ka fún ewéko kọ̀ọ̀kan (Àwòrán 4B), àti iye ewé fún ewéko kọ̀ọ̀kan (Àwòrán 4C) lẹ́yìn ọjọ́ 42. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé Rizolex-T (50 mg/L) tó ń ta oògùn olóró ló ní ipa tó ga jùlọ lórí gbogbo àwọn ìlànà oúnjẹ tí a kẹ́kọ̀ọ́, lílo 250 mg/L L-ornithine láti ara rẹ̀ ló ní ipa tó ga jùlọ ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ìdènà tí a kò tọ́jú (Àwòrán 4A–C). Ní ọwọ́ kejì ẹ̀wẹ̀, ìtọ́jú L-ornithine kò ní ipa pàtàkì lórí akoonu àwọn pigments photosynthetic chlorophyll a (Àwòrán 4D) àti chlorophyll b (Àwòrán 4E), ṣùgbọ́n ó pọ̀ sí i díẹ̀ nínú iye carotenoid (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) ní ìfiwéra pẹ̀lú ìṣàkóso odi (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) àti ìṣàkóso rere (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Àwòrán 4F). Ní ​​gbogbogbòò, àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé L-ornithine kò léwu fún àwọn ewéko tí a tọ́jú, ó sì lè mú kí ìdàgbàsókè wọn pọ̀ sí i.
Àwòrán 4. Àkóbá ìlò L-ornithine tí ó jáde láti inú ara rẹ̀ lórí àwọn ànímọ́ ìdàgbàsókè àti àwọn àwọ̀ fọ́tòsíntẹ́ẹ̀tì ti àwọn ewé ewa tí a ti kó àrùn Sclerotinia sclerotiorum lábẹ́ àwọn ipò ewéko. (A) Gíga ewéko (cm), (B) Iye àwọn ẹ̀ka fún ewéko kọ̀ọ̀kan, (C) Iye àwọn ewé fún ewéko kọ̀ọ̀kan, (D) Àkóónú Chlorophyll a (mg g-1 fr wt), (E) Àkóónú Chlorophyll b (mg g-1 fr wt), (F) Àpapọ̀ àkóónú carotenoid (mg g-1 fr wt). Àwọn ìwọ̀n ni àròpín ± SD ti àwọn àtúnṣe ẹ̀dá márùn-ún (n = 5). Àwọn lẹ́tà ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ fi ìyàtọ̀ pàtàkì hàn láàárín àwọn ìtọ́jú (p < 0.05).
Nínú ìsàlẹ̀ histochemical, ìṣàfihàn àwọn ẹ̀yà atẹ́gùn oníṣẹ́-afẹ́fẹ́ (ROS; tí a fihàn gẹ́gẹ́ bí hydrogen peroxide [H2O2]) àti àwọn free radicals (tí a fihàn gẹ́gẹ́ bí superoxide anions [O2•−]) fi hàn pé lílo L-ornithine (250 mg/L) dín ìkójọpọ̀ H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Àwòrán 5A) àti O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Àwòrán 5B) ní ìfiwéra pẹ̀lú ìkójọpọ̀ àwọn ewéko tí a kò tọ́jú (173.31 ± 12.06 àti 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, lẹ́sẹẹsẹ) àti àwọn ewéko tí a tọ́jú pẹ̀lú 50 mg/L ti oògùn olóró Rizolex-T (170.12 ± 9.50 àti 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, lẹ́sẹẹsẹ) ní wákàtí 72. Ìwọ̀n gíga ti H2O2 àti O2•− tí a kó jọ lábẹ́ hpt (Àwòrán 5A, B). Bákan náà, ìwádìí malondialdehyde (MDA) tí ó wà ní TCA fihàn pé àwọn ewa tí ó ní àkóràn S. sclerotiorum kó àwọn ìpele gíga ti MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) jọ nínú ewé wọn (Àwòrán 5C). Síbẹ̀síbẹ̀, lílo L-ornithine láti inú ìtajà náà dín ìdàpọ̀ lipid kù ní pàtàkì gẹ́gẹ́ bí a ṣe rí i nípasẹ̀ ìdínkù nínú akoonu MDA nínú àwọn ewéko tí a tọ́jú (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Àwòrán 5. Àkóbá ìlò L-ornithine tí ó jáde láti inú àwọn àmì pàtàkì ti ìdààmú oxidative àti àwọn ọ̀nà ìdènà antioxidant tí kìí ṣe enzymatic nínú àwọn ewé ewa tí ó ní S. sclerotiorum ní wákàtí 72 lẹ́yìn àkóràn lábẹ́ àwọn ipò ewéko. (A) Hydrogen peroxide (H2O2; nmol g−1 FW) ní 72 hpt, (B) anion superoxide (O2•−; nmol g−1 FW) ní 72 hpt, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) ní 72 hpt, (D) gbogbo phenols tí ó lè yọ́ (mg GAE g−1 FW) ní 72 hpt, (E) gbogbo flavonoids tí ó lè yọ́ (mg RE g−1 FW) ní 72 hpt, (F) gbogbo amino acids tí kò ní ọ̀fẹ́ (mg g−1 FW) ní 72 hpt, àti (G) akoonu proline (mg g−1 FW) ní 72 hpt. Àwọn ìwọ̀n dúró fún ìyípadà ìwọ̀n ± (àròpín ± SD) ti àwọn àtúnṣe ẹ̀dá alààyè márùn-ún (n = 5). Àwọn lẹ́tà tó yàtọ̀ fi ìyàtọ̀ pàtàkì hàn láàárín àwọn ìtọ́jú (p < 0.05).