Ẹ ṣeun fún ṣíbẹ̀wò sí Nature.com. Ẹ̀yà ẹ̀rọ ìṣàwárí tí ẹ ń lò ní àtìlẹ́yìn díẹ̀ fún CSS. Fún ìrírí tí ó dára jùlọ, a gbà yín nímọ̀ràn pé kí ẹ lo ẹ̀rọ ìṣàwárí tí a ti mú gbóná (tàbí kí ẹ pa ipò ìbáramu nínú Internet Explorer). Ní ​​àkókò yìí, láti rí i dájú pé a ń tẹ̀síwájú láti ṣe àtìlẹ́yìn, a ó máa fi ojú-ọ̀nà náà hàn láìsí àwọn àṣà àti JavaScript.
Àwọn nanoparticles insulin (NPs) pẹ̀lú akoonu fifuye giga ti ri awọn lilo oriṣiriṣi ni awọn fọọmu iwọn lilo oriṣiriṣi. Iṣẹ yii ni ero lati ṣe ayẹwo ipa ti awọn ilana gbigbẹ-didi ati gbigbẹ-sisun lori eto awọn nanoparticles chitosan ti a fi insulin kun, pẹlu tabi laisi mannitol gẹgẹbi cryoprotectant. A tun ṣe ayẹwo didara awọn nanoparticles wọnyi nipa atunkọ wọn. Ṣaaju gbigbẹ, iwọn patikulu ti awọn nanoparticles chitosan/sodium tripolyphosphate/insulin cross-linked ni a ṣe iṣapeye lati jẹ 318 nm, PDI jẹ 0.18, ṣiṣe encapsulation jẹ 99.4%, ati fifuye jẹ 25.01%. Lẹhin atunkọ, gbogbo awọn nanoparticles, ayafi awọn ti a ṣe nipasẹ ọna gbigbẹ-didi laisi lilo mannitol, ṣetọju eto patikulu iyipo wọn. Ni akawe pẹlu awọn nanoparticles ti o ni mannitol ti a ti gbẹ nipasẹ spray mejeeji, awọn nanoparticles ti a ti gbẹ laisi mannitol tun fihan iwọn patikulu ti o kere julọ (376 nm) ati akoonu fifuye ti o ga julọ (25.02%) pẹlu iru kanna. Ìwọ̀n ìdènà (98.7%) àti PDI (0.20) nípa lílo àwọn ọ̀nà gbígbẹ tàbí gbígbẹ dídì. Àwọn nanoparticles gbígbẹ nípasẹ̀ gbígbẹ sípì láìsí mannitol tún yọrí sí ìtújáde insulin kíákíá àti iṣẹ́ tó ga jùlọ ti gbígbẹ sẹ́ẹ̀lì. Iṣẹ́ yìí fihàn pé gbígbẹ sípì lè mú kí àwọn nanoparticles insulin gbẹ láìsí àìní àwọn cryoprotectants ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ọ̀nà gbígbẹ dídì déédé, èyí tó ń mú kí agbára gbígbé ẹrù pọ̀ sí i, àwọn ohun tí a nílò fún afikún àti owó iṣẹ́ pọ̀ sí i.
Láti ìgbà tí wọ́n ti ṣe àwárí rẹ̀ ní ọdún 19221,2,3, insulin àti àwọn oògùn rẹ̀ ti gba ẹ̀mí àwọn aláìsàn tí wọ́n ní àrùn àtọ̀gbẹ irú 1 (T1DM) àti àrùn àtọ̀gbẹ irú 2 (T1DM) là. Síbẹ̀síbẹ̀, nítorí àwọn ànímọ́ rẹ̀ gẹ́gẹ́ bí amuaradagba ìwọ̀n molecule gíga, insulin ni a lè kó jọ ní irọ̀rùn, tí a lè fọ́ nípa lílo àwọn enzymu proteolytic, tí a sì lè parẹ́ nípasẹ̀ ipa àkọ́kọ́-pass. Àwọn ènìyàn tí wọ́n ní àrùn àtọ̀gbẹ irú 1 nílò abẹ́rẹ́ insulin fún ìyókù ìgbésí ayé wọn. Ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn aláìsàn tí wọ́n kọ́kọ́ ṣe àyẹ̀wò nípa àrùn àtọ̀gbẹ irú 2 náà tún nílò abẹ́rẹ́ insulin fún ìgbà pípẹ́. Abẹ́rẹ́ insulin ojoojúmọ́ jẹ́ orísun ìrora àti àìbalẹ̀ ojoojúmọ́ fún àwọn ènìyàn wọ̀nyí, pẹ̀lú àwọn ipa búburú lórí ìlera ọpọlọ. Nítorí náà, àwọn ọ̀nà ìtọ́jú insulin mìíràn tí ó ń fa àìbalẹ̀ díẹ̀, bíi ìtọ́jú insulin láti ẹnu, ni a ń ṣe àyẹ̀wò rẹ̀ dáadáa5 nítorí wọ́n ní agbára láti mú ìgbésí ayé àwọn ènìyàn bílíọ̀nù márùn-ún tí wọ́n ní àrùn àtọ̀gbẹ padà sípò kárí ayé.
Ìmọ̀ ẹ̀rọ Nanoparticle ti pese ilọsiwaju pataki ninu awọn igbiyanju lati mu insulin ti a mu ni ẹnu4,6,7. Ọkan ti o n di kapusulu ati aabo fun insulin kuro ninu ibajẹ fun ifijiṣẹ ti a fojusi si awọn aaye ara kan pato. Sibẹsibẹ, lilo awọn agbekalẹ nanoparticle ni awọn idiwọn pupọ, pataki nitori awọn ọran iduroṣinṣin ti awọn idaduro patiku. Diẹ ninu awọn akojọpọ le waye lakoko ipamọ, eyiti o dinku bioavailability ti awọn nanoparticles ti a fi sinu insulin8. Ni afikun, iduroṣinṣin kemikali ti matrix polymer ti awọn nanoparticles ati insulin gbọdọ tun ni a gbero lati rii daju iduroṣinṣin ti awọn nanoparticles insulin (NPs). Lọwọlọwọ, imọ-ẹrọ gbigbẹ-didi ni boṣewa goolu fun ṣiṣẹda awọn NPs iduroṣinṣin lakoko idilọwọ awọn iyipada ti a ko fẹ lakoko ipamọ9.
Sibẹsibẹ, gbigbẹ didin nilo afikun awọn cryoprotectants lati ṣe idiwọ eto iyipo ti awọn NPs lati ni ipa nipasẹ wahala ẹrọ ti awọn kirisita yinyin. Eyi dinku ikojọpọ awọn nanoparticles insulin lẹhin lyophilization, bi cryoprotectant ṣe gba pupọ julọ ninu ipin iwuwo. Nitorinaa, awọn NPs insulin ti a ṣejade nigbagbogbo ko dara fun iṣelọpọ awọn agbekalẹ lulú gbigbẹ, gẹgẹbi awọn tabulẹti ẹnu ati awọn fiimu ẹnu, nitori iwulo fun ọpọlọpọ awọn nanoparticles gbẹ lati ṣaṣeyọri akoko itọju insulin.
Gbígbẹ omi jẹ́ ilana ile-iṣẹ ti a mọ daradara ati ti ko gbowolori fun iṣelọpọ awọn lulú gbigbẹ lati awọn ipele omi ni ile-iṣẹ oogun10,11. Iṣakoso lori ilana dida awọn patikulu gba laaye fun pipade to dara ti ọpọlọpọ awọn agbo ogun bioactive 12, 13. Pẹlupẹlu, o ti di ilana ti o munadoko fun igbaradi awọn amuaradagba ti a fi sinu apo fun lilo ẹnu. Lakoko gbigbẹ omi, omi n gbẹ ni kiakia pupọ, eyiti o ṣe iranlọwọ lati jẹ ki iwọn otutu ti inu patikulu kere11,14, ti o jẹ ki lilo rẹ lati fi awọn paati ti o ni imọlara ooru kun. Ṣaaju ki o to gbẹ omi, ohun elo ti a fi bo yẹ ki o jẹ idapọ daradara pẹlu ojutu ti o ni awọn eroja ti a fi sinu apo11,14. Ko dabi gbigbẹ didin, isọdọkan ṣaaju ki o to fi sinu apo ni gbigbẹ mu ṣiṣe imunadoko encapsulation dara lakoko gbigbẹ. Niwọn igba ti ilana fifin-gbigbẹ omi ko nilo awọn aabo cryoprotectants, a le lo gbigbẹ-gbigbẹ lati ṣe awọn NPs gbigbẹ pẹlu akoonu fifuye giga.
Ìwádìí yìí ròyìn ìṣẹ̀dá àwọn NP tí a fi insulin kún nípa lílo ọ̀nà jíìlì ion. Gílátì ion jẹ́ ọ̀nà ìpèsè tí ó gba ààyè fún ìṣẹ̀dá àwọn nanoparticles nípasẹ̀ ìbáṣepọ̀ electrostatic láàrín àwọn ẹ̀yà ionic méjì tàbí jù bẹ́ẹ̀ lọ lábẹ́ àwọn ipò kan. Àwọn ọ̀nà gbígbẹ-dídì àti fífọ́-fún-fún-ìgbó ni a lò láti mú omi kúrò nínú àwọn nanoparticles chitosan/sodium tripolyphosphate/insulin cross-linked tí a ti ṣe àtúnṣe. Lẹ́yìn gbígbẹ, a ṣe àyẹ̀wò ìrísí wọn nípasẹ̀ SEM. A ṣe àyẹ̀wò agbára ìdàpọ̀ wọn nípa wíwọ̀n ìpínkiri ìwọ̀n wọn, agbára ojú ilẹ̀, PDI, ìṣiṣẹ́ encapsulation, àti àkóónú gbígbé ẹrù. A tún ṣe àyẹ̀wò dídára àwọn nanoparticles tí a ti yípadà tí a ṣe nípasẹ̀ àwọn ọ̀nà gbígbẹ onírúurú nípa fífiwé ààbò insulin wọn, ìwà ìtúsílẹ̀, àti agbára gbígbẹ sẹ́ẹ̀lì.
pH ti ojutu adalu ati ipin ti chitosan ati insulin jẹ awọn ifosiwewe pataki meji ti o ni ipa lori iwọn patikulu ati ṣiṣe encapsulation (EE) ti awọn NPs ikẹhin, bi wọn ṣe ni ipa taara lori ilana gelation ionotropic. A fihan pe pH ti ojutu adalu ni ibatan pupọ pẹlu iwọn patikulu ati ṣiṣe encapsulation (Fig. 1a). Gẹgẹbi a ti fihan ni Fig. 1a, bi pH ti pọ si lati 4.0 si 6.0, iwọn patikulu apapọ (nm) dinku ati EE pọ si ni pataki, lakoko ti nigbati pH pọ si si 6.5, iwọn patikulu apapọ bẹrẹ si pọ si ati EE ko yipada. Bi ipin ti chitosan si insulin ṣe pọ si, iwọn patikulu apapọ tun pọ si. Pẹlupẹlu, ko si iyipada ninu EE nigbati a pese awọn nanoparticles ni ipin mass ti chitosan/insulin ti o ga ju 2.5:1 (w/w) lọ (Fig. 1b). Nitorinaa, awọn ipo igbaradi ti o dara julọ ninu iwadi yii (pH 6.0, ipin mass chitosan/insulin ti 2.5:1) ni a lo lati mura silẹ Àwọn nanoparticles tí wọ́n kún fún insulin fún ìwádìí síwájú sí i. Lábẹ́ ipò ìṣètò yìí, a ṣe àtúnṣe ìwọ̀n pàǹtíìkì insulin ní ìwọ̀n 318 nm (Àwòrán 1c), PDI jẹ́ 0.18, ìṣeéṣe ìfipamọ́ jẹ́ 99.4%, agbára zeta jẹ́ 9.8 mv, àti ìfipamọ́ insulin jẹ́ 25.01% (m/m). Gẹ́gẹ́ bí àbájáde transmission electron microscopy (TEM), àwọn nanoparticles tí a ṣe àtúnṣe náà jẹ́ onígun mẹ́rin àti aláìlábùkù pẹ̀lú ìwọ̀n tí ó dọ́gba (Àwòrán 1d).
Ìmúdàgbàsókè paramita ti awọn nanoparticles insulin: (a) ipa ti pH lori iwọn ila opin apapọ ati ṣiṣe encapsulation (EE) ti awọn nanoparticles insulin (ti a pese ni ipin ibi-5: 1 ti chitosan ati insulin); (b) chitosan ati Ipa ti ipin ibi-pupọ ti insulin lori iwọn ila opin apapọ ati ṣiṣe encapsulation (EE) ti awọn NPs insulin (ti a pese ni pH 6); (c) pinpin iwọn patiku ti awọn nanoparticles insulin ti a ṣe iṣapeye; (d) Maikirografi TEM ti awọn NPs insulin ti a ṣe iṣapeye.
Ó jẹ́ mímọ̀ dáadáa pé chitosan jẹ́ polyelectrolyte aláìlera pẹ̀lú pKa ti 6.5. Ó gba agbára rere nínú àwọn èròjà acidic nítorí pé àwọn ions hydrogen ló ń ṣe proton 15. Nítorí náà, a sábà máa ń lò ó gẹ́gẹ́ bí ohun tí ń gbé e kalẹ̀ láti fi àwọn macromolecules tí ó ní agbára òdì sí ara wọn. Nínú ìwádìí yìí, a lo chitosan láti fi ààmì isoelectric ti 5.3 sí ara insulin. Níwọ́n ìgbà tí a ń lo chitosan gẹ́gẹ́ bí ohun èlò ìbòrí, pẹ̀lú ìbísí ìwọ̀n rẹ̀, sisanra ti ìpele òde ti àwọn nanoparticles pọ̀ sí i ní ìbámu pẹ̀lú èyí tí ó yọrí sí ìwọ̀n pàǹtí tí ó pọ̀ sí i. Ní àfikún, àwọn ìpele gíga ti chitosan lè fi ààmì insulin kún ara wọn. Nínú ọ̀ràn wa, EE ga jùlọ nígbà tí ìpíndọ́gba chitosan àti insulin dé 2.5:1, kò sì sí ìyípadà pàtàkì nínú EE nígbà tí ìpíndọ́gba náà ń pọ̀ sí i.
Yàtọ̀ sí ìpíndọ́gba chitosan àti insulin, pH náà ṣe ipa pàtàkì nínú ìpèsè NPs.Gan àti àwọn ẹlòmíràn 17 ṣe ìwádìí nípa ipa pH lórí ìwọ̀n pàǹtíkì ti àwọn nanoparticles chitosan.Wọ́n rí ìdínkù nígbà gbogbo nínú ìwọ̀n pàǹtíkì títí pH fi dé 6.0, a sì rí ìbísí pàtàkì nínú ìwọ̀n pàǹtíkì ní pH > 6.0, èyí tí ó bá àwọn àkíyèsí wa mu.Ìṣẹ̀lẹ̀ yìí jẹ́ nítorí pé pẹ̀lú bí pH ṣe ń pọ̀ sí i, molecule insulin náà ń gba agbára ojú ilẹ̀ tí kò dára, nítorí náà, ó ń ṣe ojúrere fún àwọn ìbáṣepọ̀ electrostatic pẹ̀lú complex chitosan/sodium tripolyphosphate (TPP), èyí tí ó yọrí sí ìwọ̀n pàǹtíkì kékeré àti EE gíga.Ṣùgbọ́n, nígbà tí a ṣe àtúnṣe pH sí 6.5, àwọn ẹgbẹ́ amino lórí chitosan ni a yọ kúrò, èyí tí ó yọrí sí kíkó chitosan.Nítorí náà, pH gíga ń yọrí sí ìfarahàn amino ions sí TPP àti insulin díẹ̀, èyí tí ó ń yọrí sí ìsopọ̀ ìsopọ̀ tí ó kéré síi, ìwọ̀n pàǹtíkì tí ó tóbi jùlọ àti EE tí ó kéré síi.
Àyẹ̀wò àwọn ànímọ́ ìrísí ara ti àwọn NP tí a ti gbẹ tí a sì ti gbẹ tí a sì ti fọ́nká lè darí yíyan àwọn ọ̀nà ìfọ́ omi àti ìṣẹ̀dá lulú tí ó dára jùlọ. Ọ̀nà tí a fẹ́ràn jùlọ yẹ kí ó pèsè ìdúróṣinṣin oògùn, ìrísí pàtákì kan náà, ẹrù oògùn gíga àti ìyọ́ omi tí ó dára nínú omi àtilẹ̀wá náà. Nínú ìwádìí yìí, láti fi àwọn ọ̀nà méjèèjì wéra dáadáa, a lo àwọn NP insulin pẹ̀lú tàbí láìsí 1% mannitol nígbà ìfọ́ omi. A lo Mannitol gẹ́gẹ́ bí ohun tí ń mú kí omi gbóná tàbí cryoprotectant ní onírúurú àwọn ìgbékalẹ̀ lulú gbígbẹ fún gbígbẹ dìdì àti gbígbẹ dìdì. Fún àwọn nanoparticles insulin lyophilized láìsí mannitol, gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn nínú Àwòrán 2a, a ṣe àkíyèsí ìrísí lulú oníhò gíga pẹ̀lú àwọn ojú ilẹ̀ ńlá, àìdọ́gba àti tí ó le koko lábẹ́ ìwòran electron microscopy (SEM). A rí àwọn patikulu díẹ̀ tí ó yàtọ̀ nínú lulú lẹ́yìn gbígbẹ (Àwòrán 2e). Àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn NP ni a ti yọ́ nígbà gbígbẹ dìdì láìsí cryoprotectant kankan. Fún àwọn nanoparticles insulin tí a ti gbẹ tí a sì ti fọ́nká tí ó ní 1% mannitol, a ṣe àkíyèsí àwọn nanoparticles oníyípo pẹ̀lú àwọn ojú ilẹ̀ dídán (Àwòrán. 2b,d,f,h). Àwọn nanoparticles insulin tí a fi omi gbẹ láìsí mannitol wà ní àyíká ṣùgbọ́n wọ́n wọ́pọ̀ lórí ilẹ̀ (Àwòrán 2c). Àwọn ojú ilẹ̀ oníyípo àti oníyípo ni a tún jíròrò síwájú sí i nínú ìwà ìtújáde àti àwọn ìdánwò ìfàmọ́ra sẹ́ẹ̀lì ní ìsàlẹ̀. Gẹ́gẹ́ bí ìrísí tí ó hàn gbangba ti àwọn NP tí a gbẹ, àwọn NP tí a fi omi gbẹ láìsí mannitol àti àwọn NP tí a fi omi gbẹ tí a sì fi mannitol gbẹ máa ń mú àwọn lulú NPs tí ó dára jáde (Àwòrán 2f,g,h). Bí agbègbè ojú ilẹ̀ láàárín àwọn ojú ilẹ̀ oníyípo bá ṣe tóbi tó, bẹ́ẹ̀ ni ìwọ̀n ìtújáde náà yóò ṣe pọ̀ sí i, nítorí náà, ìwọ̀n ìtújáde náà yóò ga sí i.
Àwòrán ara àwọn insulin NPs tí ó ti gbẹ: (a) Àwòrán SEM ti insulin NPs tí ó ti gbẹ láìsí mannitol; (b) Àwòrán SEM ti insulin NPs tí ó ti gbẹ pẹ̀lú mannitol; (c) insulin NPs tí ó ti gbẹ láìsí mannitol Àwòrán SEM ti; (d) Àwòrán SEM ti insulin NPs tí a ti gbẹ pẹ̀lú mannitol; (e) Àwòrán insulin NPs tí ó ti gbẹ láìsí mannitol; (f) Àwòrán insulin NPs tí ó ti gbẹ pẹ̀lú mannitol; (g) Àwòrán insulin NPs tí ó ti gbẹ láìsí mannitol; (h) Àwòrán insulin NPs tí a ti gbẹ pẹ̀lú mannitol.
Nígbà gbígbẹ dídì, mannitol ń ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí ohun ààbò cryo, ó ń pa NPs mọ́ ní ìrísí amorphous àti dídènà ìbàjẹ́ láti ọwọ́ àwọn kirisita yìnyín19. Ní ìyàtọ̀ sí èyí, kò sí ìgbésẹ̀ dídì nígbà gbígbẹ sídì. Nítorí náà, a kò nílò mannitol nínú ọ̀nà yìí. Ní tòótọ́, àwọn NP tí a fi sídì tí kò ní mannitol mú àwọn NP tí ó dára jù jáde gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀. Síbẹ̀síbẹ̀, mannitol ṣì lè ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí ohun tí a fi kún nínú ìlànà gbígbẹ sídì láti fún àwọn NPs ní ìrísí onígun mẹ́rẹ̀ẹ̀rin (Àwòrán 2d), èyí tí ó ń ran lọ́wọ́ láti ní ìhùwàsí ìtújáde kan náà ti irú àwọn NP tí a fi sídì. Ní àfikún, ó ṣe kedere pé a lè rí àwọn pàtákì ńlá kan nínú àwọn NP insulin tí a fi sídì tí ó gbẹ àti tí a fi sídì tí ó ní mannitol (Àwòrán 2b,d), èyí tí ó lè jẹ́ nítorí ìkójọpọ̀ mannitol nínú mojuto pàtákì pẹ̀lú insulin tí a fi sídì. Sí. Àwọ̀ Chitosan. Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé nínú ìwádìí yìí, láti rí i dájú pé ìrísí àyíká náà dúró ní ìbámu lẹ́yìn gbígbẹ omi, a pa ìpíndọ́gba mannitol àti chitosan mọ́ ní 5:1, kí iye púpọ̀ ti ohun tí a fi kún lè mú kí ìwọ̀n pàǹtírọ́ọ̀kì àwọn NP tí a ti gbẹ pọ̀ sí i.
Ìwòran FTIR-ATR (Furier transform infrared attenuated total reflection) ṣe àfihàn àdàpọ̀ ara ti insulin ọ̀fẹ́, chitosan, chitosan, TPP àti insulin. Gbogbo àwọn NP tí ó ti gbẹ ni a ṣe àfihàn nípa lílo FTIR-ATR spectroscopy. Lóòótọ́, a ṣe àkíyèsí ìfúnpọ̀ 1641, 1543 àti 1412 cm-1 nínú àwọn NP tí a fi mannitol gbẹ tí a sì fi spray-drying NPs pẹ̀lú mannitol àti láìsí (Àwòrán 3). Gẹ́gẹ́ bí a ti ròyìn tẹ́lẹ̀, àwọn ìbísí agbára wọ̀nyí ní í ṣe pẹ̀lú ìsopọ̀pọ̀ láàárín chitosan, TPP àti insulin. Ìwádìí ìbáṣepọ̀ láàárín chitosan àti insulin fihàn pé nínú àwọn FTIR spectra ti àwọn nanoparticles chitosan tí a fi insulin kún, ìfúnpọ̀ chitosan dúró pẹ̀lú ti insulin, ó ń mú kí agbára carbonyl (1641 cm-1) àti amine (1543 cm-1) pọ̀ sí i. Àwọn ẹgbẹ́ tripolyphosphate ti TPP so pọ̀ mọ́ àwọn ẹgbẹ́ ammonium nínú chitosan, wọ́n sì ń ṣẹ̀dá ìfúnpọ̀ kan ní 1412 cm-1.
Ìwòrán FTIR-ATR ti insulin ọ̀fẹ́, chitosan, àdàpọ̀ ara ti chitosan/TPP/insulin àti NP tí a ti gbẹ nípa lílo ọ̀nà ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀.
Síwájú sí i, àwọn àbájáde wọ̀nyí bá àwọn tí a fihàn nínú SEM mu, èyí tí ó fihàn pé àwọn NP tí a fi sínú àpò náà dúró ní ipò tí ó yẹ nígbà tí a fi mannitol fún un tí a sì fi sínú rẹ̀ gbẹ, ṣùgbọ́n ní àìsí mannitol, gbígbẹ-fún-ún nìkan ni ó ń mú àwọn èròjà tí a fi sínú àpò náà jáde. Ní ìyàtọ̀ sí èyí, àwọn àbájáde FTIR-ATR ti àwọn NP tí a fi sínú rẹ̀ gbẹ láìsí mannitol jọra gan-an sí àdàpọ̀ ara ti chitosan, TPP, àti insulin. Àbájáde yìí fihàn pé àwọn ìjápọ̀ láàárín chitosan, TPP àti insulin kò sí mọ́ nínú àwọn NP tí a fi sínú rẹ̀ gbẹ láìsí mannitol. A pa ètò NPs run nígbà gbígbẹ-fún-ún láìsí cryoprotectant, èyí tí a lè rí nínú àwọn àbájáde SEM (Àwòrán 2a). Gẹ́gẹ́ bí ìrísí àti àwọn àbájáde FTIR ti àwọn NP tí a fi sínú rẹ̀ gbẹ, àwọn NP tí a fi sínú rẹ̀ gbẹ, tí a fi sínú rẹ̀ gbẹ, àti àwọn NP tí kò ní mannitol nìkan ni a lò fún àwọn àdánwò àtúnṣe àti àwọn NP tí kò ní mannitol nítorí ìbàjẹ́ àwọn NP tí kò ní mannitol nígbà gbígbẹ. jíròrò.
A lo omi gbígbẹ fún ìtọ́jú àti àtúnṣe sí àwọn ìṣètò mìíràn fún ìgbà pípẹ́. Agbára àwọn NP gbígbẹ láti tún ṣe lẹ́yìn ìtọ́jú ṣe pàtàkì fún lílò wọn nínú onírúurú ìṣètò bíi tábìlẹ́ẹ̀tì àti fíìmù. A kíyèsí pé ìwọ̀n pàtákì ti insulin NPs tí a fi omi gbígbẹ ṣe láìsí mannitol pọ̀ sí i díẹ̀ lẹ́yìn ìtúnṣe. Ní ọwọ́ kejì ẹ̀wẹ̀, ìwọ̀n pàtákì ti insulin nanoparticles tí a fi omi gbígbẹ ṣe tí a sì fi omi dì pẹ̀lú mannitol pọ̀ sí i ní pàtàkì (Tábìlẹ́ẹ̀tì 1). PDI àti EE kò yípadà ní pàtàkì (p > 0.05) lẹ́yìn ìdàpọ̀ gbogbo NPs nínú ìwádìí yìí (Tábìlẹ́ẹ̀tì 1). Àbájáde yìí fihàn pé ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn pàtákì náà wà ní ipò kan lẹ́yìn ìtúnṣe. Síbẹ̀síbẹ̀, àfikún mannitol yọrí sí ìdínkù nínú ìpèsè insulin ti àwọn lyophilized àti spray-dried nanoparticles (Tábìlẹ́ẹ̀tì 1). Ní ​​ìyàtọ̀ sí èyí, ìwọ̀n pàtákì ti NPs tí a fi omi gbígbẹ ṣe láìsí mannitol dúró gẹ́gẹ́ bí ti tẹ́lẹ̀ (Tábìlẹ́ẹ̀tì 1).
Ó jẹ́ mímọ̀ dáadáa pé gbígbé àwọn nanoparticles sínú ara ṣe pàtàkì nígbà tí a bá lò ó fún ìfiránṣẹ́ oògùn. Fún àwọn NP tí wọ́n ní ẹrù díẹ̀, iye ohun èlò tó pọ̀ gan-an ni a nílò láti dé ààlà ìtọ́jú. Síbẹ̀síbẹ̀, ìfọ́síwájú gíga irú àwọn NP gíga bẹ́ẹ̀ máa ń yọrí sí àìnírètí àti ìṣòro nínú lílo ẹnu àti àwọn àgbékalẹ̀ abẹ́rẹ́, lẹ́sẹẹsẹ 22. Ní àfikún, a tún lè lo insulin NPs láti ṣe àwọn tábìlẹ́ẹ̀tì àti viscous biofilms23, 24, èyí tí ó nílò lílo ọ̀pọ̀lọpọ̀ NPs ní àwọn ìpele ìfiránṣẹ́ kékeré, èyí tí ó ń yọrí sí àwọn tábìlẹ́ẹ̀tì ńlá àti biofilms tí ó nípọn tí kò yẹ fún lílo ẹnu. Nítorí náà, àwọn NP tí ó ti gbẹ pẹ̀lú ẹrù insulin gíga jẹ́ ohun tí a fẹ́ gidigidi. Àwọn àbájáde wa fihàn pé ẹrù insulin gíga ti àwọn NP tí a ti gbẹ tí kò ní spray-spray lè fúnni ní ọ̀pọ̀lọpọ̀ àǹfààní tí ó wúni lórí fún àwọn ọ̀nà ìfiránṣẹ́ mìíràn wọ̀nyí.
Gbogbo àwọn NP tí ó ti gbẹ ni a fi pamọ́ sínú fìríìjì fún oṣù mẹ́ta. Àwọn àbájáde SEM fihàn pé ìrísí gbogbo àwọn NP tí ó ti gbẹ kò yí padà ní pàtàkì ní àkókò ìfipamọ́ oṣù mẹ́ta náà (Àwòrán 4). Lẹ́yìn tí a tún ṣe àtúnṣe sínú omi, gbogbo àwọn NP fi ìdínkù díẹ̀ hàn nínú EE wọ́n sì tú ìwọ̀n díẹ̀ jáde (~5%) ti insulin ní àkókò ìfipamọ́ oṣù mẹ́ta náà (Àtẹ 2). Síbẹ̀síbẹ̀, ìwọ̀n patiku apapọ ti gbogbo awọn nanoparticles pọ̀ sí i. Ìwọ̀n patiku ti àwọn NP tí a fi sọ́ omi láìsí mannitol pọ̀ sí i sí 525 nm, nígbà tí ti àwọn NP tí a fi sọ́ omi gbígbẹ àti tí a fi sọ́ omi pẹ̀lú mannitol pọ̀ sí i sí 872 àti 921 nm, lẹ́sẹẹsẹ (Àtẹ 2).
Àwòrán àwọn NP insulin tí ó ti gbẹ tí a tọ́jú fún oṣù mẹ́ta: (a) Àwòrán SEM ti NP insulin tí a ti yọ lyophilized pẹ̀lú mannitol; (b) Àwòrán SEM ti àwọn NNOP insulin tí a ti gbẹ tí a ti fọ́n síta láìsí mannitol; (c) láìsí mannitol àwọn àwòrán SEM ti NP insulin tí a ti gbẹ síta.
Síwájú sí i, a rí àwọn ìṣàn omi nínú àwọn nanoparticles insulin tí a tún ṣe tí a fi mannitol gbẹ tí a sì gbẹ (Àwòrán S2). Èyí lè jẹ́ nítorí àwọn patikulu ńlá tí kò dúró dáadáa nínú omi. Gbogbo àwọn àbájáde tí ó wà lókè yìí fihàn pé ọ̀nà gbígbẹ fún fífọ́ lè dáàbò bo àwọn nanoparticles insulin kúrò nínú gbígbẹ àti pé a lè gba àwọn nanoparticles insulin púpọ̀ láìsí àwọn ohun tí a fi kún tàbí àwọn ohun tí ń mú kí ó bàjẹ́.
A dán ìdúró insulini wò ní pH = 2.5 alabọde pẹ̀lú pepsin, trypsin, àti α-chymotrypsin láti fi agbára ààbò àwọn NPs hàn lòdì sí jíjẹ enzymatic lẹ́yìn gbígbẹ. A fi ìdúró insulini ti àwọn NPs tí ó ti gbẹ wéra pẹ̀lú ti àwọn NPs tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ pèsè, a sì lo insulini ọ̀fẹ́ gẹ́gẹ́ bí ìdarí odi. Nínú ìwádìí yìí, insulini ọ̀fẹ́ fi ìyọkúrò insulini kíákíá hàn láàárín wákàtí mẹ́rin nínú gbogbo àwọn ìtọ́jú enzymatic mẹ́ta (Àwòrán 5a–c). Ní ​​ìyàtọ̀ sí èyí, ìdánwò ìyọkúrò insulini ti àwọn NPs tí a ti dì pẹ̀lú mannitol àti àwọn NPs tí a ti fọ́n pẹ̀lú tàbí láìsí mannitol fi ààbò gíga hàn ti àwọn NPs wọ̀nyí lòdì sí jíjẹ enzymatic, èyí tí ó jọ ti insulini NPs tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ pèsè (àwòrán 1).5a-c). Pẹ̀lú ìrànlọ́wọ́ àwọn nanoparticles nínú pepsin, trypsin, àti α-chymotrypsin, a lè dáàbò bo ju 50%, 60%, àti 75% ti insulini lọ láàrín wákàtí mẹ́rin, lẹ́sẹẹsẹ (Àwòrán 5a–c). Agbára ààbò insulini yìí lè mú kí àǹfààní insulini tí ó ga jù pọ̀ sí i. Fífà sínú ẹ̀jẹ̀25. Àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé gbígbẹ fún omi pẹ̀lú tàbí láìsí mannitol àti gbígbẹ pẹ̀lú mannitol lè pa agbára ààbò insulin mọ́ ti àwọn NP lẹ́yìn gbígbẹ omi.
Ààbò àti ìhùwàsí ìtújáde àwọn NPs insulin tí ó ti gbẹ: (a) ààbò insulin nínú omi pepsin; (b) ààbò insulin nínú omi trypsin; (c) ààbò insulin nípasẹ̀ omi α-chymotrypsin; (d) Ìhùwàsí ìtújáde àwọn NP tí ó ti gbẹ nínú pH = omi 2.5; (e) ìhùwàsí ìtújáde àwọn NP tí ó ti gbẹ nínú pH = omi 6.6; (f) ìhùwàsí ìtújáde àwọn NP tí ó ti gbẹ nínú pH = omi 7.0.
A fi insulin gbígbẹ tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ pèsè sílẹ̀ àti èyí tí a tún ṣe àtúnṣe sínú onírúurú buffers (pH = 2.5, 6.6, 7.0) ní 37 °C, èyí tí ó ń ṣe àfarawé àyíká pH ti ikùn, duodenum, àti ìfun kékeré òkè, láti ṣàyẹ̀wò ipa insulin lórí ìdènà insulin. Ìhùwàsí ìtújáde ní àwọn àyíká tó yàtọ̀ síra. Ìpínyà ti ọ̀nà ìfun. Ní pH = 2.5, àwọn NP tí insulin ti kún àti àwọn NP tí insulin ti gbẹ tí a ti mú jáde fi ìtújáde ìbúgbàù àkọ́kọ́ hàn láàrín wákàtí kan àkọ́kọ́, lẹ́yìn náà ni ìtújáde díẹ̀díẹ̀ ní àwọn wákàtí márùn-ún tó tẹ̀lé e (Àwòrán 5d). Ìtújáde kíákíá yìí ní ìbẹ̀rẹ̀ jẹ́ àbájáde ìtújáde kíákíá ti àwọn molecule amuaradagba tí kò ṣeé gbé ní ìrísí inú ti patiku náà. Ní pH = 6.5, àwọn NP tí insulin ti kún àti àwọn NP insulin gbígbẹ tí a tún ṣe fi ìtújáde tí ó rọrùn àti lọ́ra hàn lórí wákàtí mẹ́fà, nítorí pé pH ti ojutu idanwo náà jọ ti ojutu tí NP ti pèsè (Àwòrán 5e). Ní ​​pH = 7, àwọn NP kò dúró ṣinṣin wọ́n sì fẹ́rẹ̀ẹ́ bàjẹ́ pátápátá láàrín wákàtí méjì àkọ́kọ́ (Àwòrán 5f). Èyí jẹ́ nítorí pé ìtújáde chitosan máa ń wáyé ní pH gíga, èyí tí ó ń yọrí sí nẹ́tíwọ́ọ̀kì polymer tí kò pọ̀ tó àti ìtújáde insulin tí a ti kún.
Síwájú sí i, àwọn insulin NPs tí a fi omi ṣan láìsí mannitol fi ìtújáde tí ó yára ju àwọn NPs mìíràn tí ó ti gbẹ lọ (Àwòrán 5d–f). Gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀, insulin NPs tí a tún ṣe tí a ti gbẹ láìsí mannitol fi ìwọ̀n patiku tí ó kéré jùlọ hàn. Àwọn patiku kékeré ń pèsè agbègbè tí ó tóbi jù, nítorí náà ọ̀pọ̀lọpọ̀ oògùn tí ó báramu yóò wà ní ojú patiku tàbí nítòsí rẹ̀, èyí tí yóò yọrí sí ìtújáde oògùn kíákíá26.
A ṣe ìwádìí nípa ìfàjẹ̀sí àwọn NPs nípasẹ̀ àyẹ̀wò MTT. Gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn nínú Àwòrán S4, gbogbo àwọn NPs tí wọ́n ti gbẹ ni a rí pé wọn kò ní ipa pàtàkì lórí bí sẹ́ẹ̀lì ṣe lè ṣiṣẹ́ dáadáa ní ìwọ̀n 50–500 μg/ml, èyí tí ó fihàn pé gbogbo àwọn NP tí wọ́n ti gbẹ ni a lè lò láìléwu láti dé ojú ìwòsàn.
Ẹ̀dọ̀ ni ẹ̀yà ara pàtàkì tí insulin fi ń ṣiṣẹ́ iṣẹ́ ara rẹ̀. Àwọn sẹ́ẹ̀lì HepG2 jẹ́ ìlà sẹ́ẹ̀lì hepatoma ènìyàn tí a sábà máa ń lò gẹ́gẹ́ bí àpẹẹrẹ ìfàmọ́ra hepatocyte in vitro. Níbí, a lo àwọn sẹ́ẹ̀lì HepG2 láti ṣe àyẹ̀wò ìfàmọ́ra sẹ́ẹ̀lì ti àwọn NP tí wọ́n ti gbẹ nípa lílo àwọn ọ̀nà gbígbẹ-dídì àti gbígbẹ-fún ... àwọn.Ẹgbẹ́ ìfúnni-insulin FITC, lẹ́sẹẹsẹ (Àwòrán 6b).Àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé ìfúnni-insulin tí a fi sínú àpò náà lágbára ju ìfúnni-insulin ọ̀fẹ́ lọ, ní pàtàkì nítorí pé ìwọ̀n kékeré ti àwọn nanoparticles tí a fi insulin kún tí a ṣe nínú ìwádìí náà kéré sí i.
Gbígbà tí a mú sẹ́ẹ̀lì HepG2 gbà lẹ́yìn wákàtí mẹ́rin tí a fi NP tuntun tí a ti múra sílẹ̀ àti àwọn NP tí a ti gbẹ: (a) Pínpín gbígbà FITC-insulin nípasẹ̀ àwọn sẹ́ẹ̀lì HepG2.(b) Ìwọ̀n ìfúnpọ̀ ìmọ́lẹ̀ oníwọ̀n tí a ṣàyẹ̀wò nípasẹ̀ ìṣàn cytometry (n = 3), *P < 0.05 ní ìfiwéra pẹ̀lú insulin ọ̀fẹ́.
Bákan náà, àwọn àwòrán CLSM fihàn pé agbára ìfọ́nrán FITC ti àwọn NP tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ pèsè sílẹ̀ fún FITC-insulin-loaded àti FITC-insulin-loaded spray-dried NPs (láìsí mannitol) lágbára ju ti àwọn àpẹẹrẹ mìíràn lọ (Àwòrán 6a). Jù bẹ́ẹ̀ lọ, pẹ̀lú àfikún mannitol, ìfọ́nrán tí ó ga jùlọ ti ojutu náà mú kí resistance sí gbigba sẹ́ẹ̀lì pọ̀ sí i, èyí tí ó yọrí sí ìdínkù nínú ìdàgbàsókè insulin. Àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé àwọn NP tí a gbẹ láìsí spray-free mannitol fi agbára ìgbara sẹ́ẹ̀lì tí ó ga jùlọ hàn nítorí pé ìwọ̀n pàǹtí wọn kéré ju ti àwọn NP tí a gbẹ lẹ́yìn tí a tún túká.
A ra Chitosan (ìwọ̀n molikula apapọ 100 KDa, 75–85% deacetylated) lati Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Canada). A ra Sodium tripolyphosphate (TPP) lati VWR (Radnor, Pennsylvania, USA). Insulin eniyan ti a tun ṣe atunṣe ti a lo ninu iwadi yii wa lati Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). A ra insulin eniyan ti a fi aami si Fluorescein isothiocyanate (FITC) ati 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) lati Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Canada). A gba laini sẹẹli HepG2 lati ATCC (Manassas, Virginia, USA). Gbogbo awọn reagents miiran jẹ ipele analytical tabi chromatographic.
Ṣe àtúnṣe omi CS 1 mg/ml nípa títú u sínú omi tí a ti tú sí méjì (omi DD) tí ó ní 0.1% acetic acid. Ṣe àtúnṣe omi 1 mg/ml ti TPP àti insulin nípa títú wọn sínú omi DD àti 0.1% acetic acid, lẹ́sẹẹsẹ. A ṣe àtúnṣe emulsion náà pẹ̀lú polytron PCU-2-110 high speed homogenizer (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Ìlànà ìṣètò náà nìyí: ní àkọ́kọ́, a fi 2ml ti omi TPP kún 4ml ti omi insulin, a sì da adalu náà fún 30 min kí a sì dà á pọ̀ pátápátá. Lẹ́yìn náà, a fi omi adalu kún omi CS nípasẹ̀ syringe lábẹ́ ìrọ̀rùn gíga (10,000 rpm). A fi àwọn adalu náà sí abẹ́ ìrọ̀rùn gíga (15,000 rpm) nínú ìwẹ̀ yìnyín fún ìṣẹ́jú 30, a sì ṣe àtúnṣe sí pH kan láti gba insulin NPs tí a ti so pọ̀ mọ́ ara wọn. Láti túbọ̀ ṣe àtúnṣe àti dín ìwọ̀n pàǹtí insulin NPs kù, a fi sonicated wọn fún afikun iṣẹju 30 ninu iwẹ yinyin nipa lilo sonicator iru probe (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germany).
A dán Insulin NPS wò fún ìwọ̀n Z-average diameter, polydispersity index (PDI) àti zeta potential nípa lílo ìwọ̀n dynamic light scattering (DLS) nípa lílo Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) nípa lílo omi DD ní 25°C. A ṣe àfihàn morphology àti ìpínkiri iwọn nípasẹ̀ Hitachi H7600 transmission electron microscope (TEM) (Hitachi, Tokyo, Japan), lẹ́yìn náà a ṣe àyẹ̀wò àwọn àwòrán nípa lílo software Hitachi imaging (Hitachi, Tokyo, Japan). Láti ṣe àyẹ̀wò bí encapsulation ṣe ń ṣiṣẹ́ (EE) àti agbára loading (LC) ti insulin NPs, a fi NPs sínú àwọn tubes ultrafiltration pẹ̀lú gígé ìwọ̀n molikula ti 100 kDa àti centrifuge ní 500 xg fún ìṣẹ́jú 30. A ṣe ìwọ̀n insulin tí kò ní ìdènà nínú filtrate nípa lílo ètò Agilent 1100 Series HPLC (Agilent, Santa Clara, California, USA) tí ó ní quaternary pump, apẹẹrẹ aláfọwọ́ṣe, ohun èlò ìgbóná, àti ohun èlò ìwádìí DAD. A ṣe àyẹ̀wò insulin nípasẹ̀ ọ̀wọ́n C18 kan (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, USA) a sì rí i ní 214 nm. Ìsọ̀rí aláfọwọ́ṣe náà jẹ́ acetonitrile àti omi, tí ó ní 0.1% TFA, àwọn ìpíndọ́gba gradient láti 10/90 sí 100/0, ó sì ṣiṣẹ́ fún ìṣẹ́jú 10. A fa ìsọ̀rí aláfọwọ́ṣe náà ní ìwọ̀n ìṣàn ti 1.0 ml/min. A ṣètò ìwọ̀n otútù ọ̀wọ̀n sí 20 °C. Ṣe ìṣirò ìpíndọ́gba ti EE àti LC nípa lílo àwọn ìṣirò.(1) àti Eq.(2).
A dán onírúurú ìwọ̀n CS/insulin láti 2.0 sí 4.0 wò láti mú insulin NP sunwọ̀n síi. A fi onírúurú ìwọ̀n omi CS kún un nígbà ìpèsè náà, nígbà tí a pa àdàpọ̀ insulin/TPP mọ́. A pèsè àwọn NP insulin nínú ìwọ̀n pH 4.0 sí 6.5 nípa ṣíṣàkóso pH adalu náà pẹ̀lú ìṣọ́ra lẹ́yìn fífi gbogbo àwọn ojutu (insulin, TPP àti CS) kún un. A ṣe àyẹ̀wò ìwọ̀n EE àti ìwọ̀n patiku ti àwọn nanoparticles insulin ní onírúurú ìwọ̀n pH àti CS/insulin mass ratios láti mú kí ìṣẹ̀dá insulin NP sunwọ̀n síi.
A gbé àwọn NP insulin tí a ti ṣe àtúnṣe sí orí àpótí aluminiomu a sì fi tẹ́ẹ̀pù bò ó. Lẹ́yìn náà, a gbé àwọn àpótí tí a fi nǹkan dì sínú ẹ̀rọ gbígbẹ yìnyín Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) tí a fi ẹ̀rọ gbígbẹ atẹ ṣe. A ṣètò iwọn otutu àti ìfúnpá afẹ́fẹ́ sí -10 °C, 0.350 Torr fún wákàtí méjì àkọ́kọ́, àti 0 °C àti 0.120 Torr fún wákàtí 22 tó kù nínú wákàtí 24 láti gba NP insulin gbígbẹ.
A lo Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Switzerland) lati ṣe agbejade insulin ti a fi sinu kapusulu. Awọn paramita gbigbẹ ti a yan ni: iwọn otutu 100 °C, sisan ifunni 3 L/min, ati sisan gaasi 4 L/min.
A lo FTIR-ATR spectroscopy láti ṣe àfihàn àwọn NPs insulin kí ó tó di gbígbẹ àti lẹ́yìn gbígbẹ. A ṣe àyẹ̀wò àwọn nanoparticles tí wọ́n ti gbẹ, àti insulin ọ̀fẹ́ àti chitosan nípa lílo Spectrum 100 FTIR spectrophotometer (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) tí a fi ẹ̀rọ ìṣàyẹ̀wò ATR gbogbogbòò (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) tí a fi ṣe àgbékalẹ̀. A gba ìwọ̀n àmì láti inú àwọn ìwòran 16 ní ìpinnu 4 cm2 nínú ìwọ̀n ìgbìyànjú 4000-600 cm2.
A ṣe àyẹ̀wò ìrísí NPs insulin gbígbẹ nípa lílo àwọn àwòrán SEM ti NPs insulin gbígbẹ tí a ti dì sínú dìdì àti tí a ti gbẹ tí Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA) mú. Pílátà pàtàkì tí a lò ni folti 5 keV àti current 30 mA.
Gbogbo insulin NPs tí ó ti gbẹ ni a tún tú dà sínú omi dd. A tún dán iwọn patiku, PDI, EE àti LC wò nípa lílo ọ̀nà kan náà tí a mẹ́nu kàn tẹ́lẹ̀ láti ṣe àyẹ̀wò dídára wọn lẹ́yìn gbígbẹ omi. A tún wọn ìdúróṣinṣin anhydroinsulin NPs nípa ṣíṣe àyẹ̀wò àwọn ànímọ́ NPs lẹ́yìn ìpamọ́ pípẹ́. Nínú ìwádìí yìí, gbogbo NPs lẹ́yìn gbígbẹ omi ni a tọ́jú sínú fìríìjì fún oṣù mẹ́ta. Lẹ́yìn oṣù mẹ́ta tí a ti fi pamọ́, a dán NPs wò fún ìwọ̀n morphological patiku, PDI, EE àti LC.
Tú 5 mL ti awọn NPs ti a tunṣe sinu 45 mL ti o ni omi inu ti a ṣe apẹẹrẹ (pH 1.2, ti o ni 1% pepsin), omi inu (pH 6.8, ti o ni 1% trypsin) tabi omi chymotrypsin (100 g/mL, ninu apo phosphate, pH 7.8) lati ṣe ayẹwo ipa ti insulin ninu aabo awọn NPs lẹhin gbigbẹ. A fi wọn sinu ina ni 37°C pẹlu iyara igbiyanju ti 100 rpm. 500 μL ti ojutu naa ni awọn aaye akoko oriṣiriṣi ati pe HPLC pinnu ifọkansi insulin naa.
A dán ìhùwàsí ìtújáde in vitro ti insulin NPs tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ pèsè àti èyí tí ó ti gbẹ wò nípa lílo ọ̀nà àpò dialysis (gé ìwọ̀n molecular 100 kDa, Spectra Por Inc.). A fi àwọn NPs gbígbẹ tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ pèsè àti èyí tí a tún ṣe àtúnṣe sínú omi ní pH 2.5, pH 6.6, àti pH 7.0 (0.1 M phosphate-buffered saline, PBS) láti ṣe àfarawé àyíká pH ti ikùn, duodenum, àti òkè ìfun kékeré, lẹ́sẹẹsẹ. Gbogbo àwọn àpẹẹrẹ ni a fi sínú iná ní 37 °C pẹ̀lú ìgbọ̀nsẹ̀ tí ń bá a lọ ní 200 rpm. Fi omi náà síta àpò dialysis 5 mL ní àwọn àkókò wọ̀nyí: 0.5, 1, 2, 3, 4, àti 6, kí o sì fi dialysate tuntun kún iye rẹ̀ lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀. A ṣe àyẹ̀wò ìbàjẹ́ insulin nínú omi náà nípasẹ̀ HPLC, a sì ṣírò ìwọ̀n ìtújáde insulin láti inú àwọn nanoparticles láti ìpíndọ́gba insulin ọ̀fẹ́ tí a tú jáde sí gbogbo insulin tí a fi sínú àwọn nanoparticles (Ìbáramu 3).
A gbin àwọn sẹ́ẹ̀lì àrùn jẹjẹrẹ hepatocellular ènìyàn ní ìwọ̀n 60 mm nípa lílo Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) tí ó ní 10% serum ẹran ọsìn ọmọ inú oyun, 100 IU/mL penicillin, àti 100 μg/mL streptomycin29. A tọ́jú àwọn àṣà ní 37°C, 95% ọriniinitutu ibatan, àti 5% CO2. Fún àwọn àyẹ̀wò gbígbà, a gbìn àwọn sẹ́ẹ̀lì HepG2 ní 1 × 105 sẹ́ẹ̀lì/ml sórí ètò ìṣàfihàn yàrá Nunc Lab-Tek 8-well (Thermo Fisher, NY, USA). Fún àwọn àyẹ̀wò cytotoxicity, a gbìn wọ́n sínú àwọn àwo 96-well (Corning, NY, USA) ní ìwọ̀n 5 × 104 sẹ́ẹ̀lì/ml.
A lo àyẹ̀wò MTT láti ṣe àyẹ̀wò ìbàjẹ́ ara àwọn insulin NPs30 tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ pèsè sílẹ̀ tí ó sì ti gbẹ. A gbìn àwọn sẹ́ẹ̀lì HepG2 sínú àwọn àwo 96-well ní ìwọ̀n 5 × 104 cells/mL, a sì gbìn wọ́n fún ọjọ́ méje kí a tó ṣe àyẹ̀wò náà. A fi omi pò àwọn insulin NPs sí onírúurú ìfọ́pọ̀ (50 sí 500 μg/mL) nínú àwo culture, lẹ́yìn náà a fi wọ́n sínú àwọn cells. Lẹ́yìn wákàtí 24 tí a ti fi incubation wẹ̀ àwọn cells ní ìgbà mẹ́ta pẹ̀lú PBS, a sì fi medium tí ó ní 0.5 mg/ml MTT sínú wọn fún wákàtí mẹ́rin sí i. A ṣe àyẹ̀wò ìbàjẹ́ ara nípa wíwọ̀n ìdínkù enzymatic ti tetrazolium MTT yellow sí purple formazan ní 570 nm nípa lílo ohun èlò Tecan infinite M200 pro spectrophotometer plate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland).
A dán ìṣiṣẹ́ gbígbà sẹ́ẹ̀lì ti NPs wò nípa lílo ohun èlò ìwádìí laser confocal àti ìwádìí ìṣàn sẹ́ẹ̀lì flow cytometry. Kọ́kan lára ​​àwọn kànga Nunc Lab-Tek chamber slide system ni a fi FITC-insulin ọ̀fẹ́, FITC-insulin-loaded NPs, a sì tún ṣe àtúnṣe 25 μg/mL ti FITC-insulin NPs tí ó ti gbẹ ní ìṣọ̀kan kan náà tí a sì fi sínú rẹ̀ fún wákàtí mẹ́rin. A fọ àwọn sẹ́ẹ̀lì náà ní ìgbà mẹ́ta pẹ̀lú PBS a sì tún fi 4% paraformaldehyde ṣe. A fi 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kun àwọn nuclei. A ṣe àkíyèsí ibi tí a ń lo ohun èlò ìwádìí laser Olympus FV1000/microscope confocal two-photon (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Japan). Fún ìṣàyẹ̀wò flow cytometry, a fi àwọn ìṣọ̀kan kan náà ti FITC-insulin ọ̀fẹ́ 10 μg/mL, FITC-insulin-loaded NPs, àti àwọn NPs tí ó ti gbẹ FITC-insulin tí a ti gbẹ kún àwọn àwo 96 tí a fi àwọn sẹ́ẹ̀lì HepG2 ṣe àti tí a fi sínú ihò fún wákàtí mẹ́rin. Lẹ́yìn wákàtí mẹ́rin tí a fi sínú ihò, a yọ àwọn sẹ́ẹ̀lì kúrò, a sì fi FBS wẹ̀ wọ́n ní ìgbà mẹ́ta. A ṣe àyẹ̀wò àwọn sẹ́ẹ̀lì 5 × 104 fún àpẹẹrẹ kọ̀ọ̀kan nípasẹ̀ BD LSR II flow cytometer (BD, Franklin Lakes, New Jersey, United States).
Gbogbo iye ni a fihan gẹgẹbi apapọ ± iyatọ boṣewa. A ṣe ayẹwo awọn afiwe laarin gbogbo awọn ẹgbẹ nipa lilo ANOVA ọna kan tabi idanwo t nipasẹ IBM SPSS Statistics 26 fun Mac (IBM, Endicott, New York, USA) ati pe a ka p < 0.05 si pataki ni iṣiro.
Ìwádìí yìí fi bí gbígbẹ omi ṣe ń yọ́ omi kúrò nínú àwọn nanoparticles chitosan/TPP/insulin pẹ̀lú àtúnṣe tó dára jù ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ọ̀nà gbígbẹ omi tí a fi ń dì í nípa lílo àwọn ohun èlò ìgbóná tàbí agbára ìfọ́mọ́ra àti agbára ẹrù tó ga jù. Àwọn nanoparticles insulin tí a ṣe àtúnṣe mú kí ìwọ̀n patiku tó jẹ́ 318 nm àti agbára ìdènà 99.4%.Àwọn àbájáde SEM àti FTIR lẹ́yìn gbígbẹ omi fihàn pé a ń ṣe àtúnṣe ìrísí sphere nínú àwọn NP tí a fi omi pò pẹ̀lú àti láìsí mannitol àti tí a fi mannitol pò, ṣùgbọ́n àwọn NP tí a fi omi pò láìsí mannitol ni a ti yọ́ kúrò nígbà gbígbẹ omi. Nínú ìdánwò agbára ìtúnṣe, àwọn nanoparticles insulin tí a fi omi pò láìsí mannitol fi ìwọ̀n patiku tó kéré jùlọ hàn àti ẹrù tó ga jùlọ nígbà àtúnṣe omi. Àwọn ìwà ìtújáde gbogbo àwọn NP tí a fi omi pò wọ̀nyí fihàn pé a tú wọn jáde kíákíá nínú àwọn omi pH = 2.5 àti pH = 7, wọ́n sì dúró ṣinṣin nínú omi pH = 6.5. Ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn NP tí a fi omi pò mìíràn tí a ti yọ́, àwọn NP tí a fi omi pò láìsí mannitol fi ìtújáde tó yára jùlọ hàn. Àbájáde yìí bá èyí tí a rí nínú àyẹ̀wò ìfàmọ́ra sẹ́ẹ̀lì mu, nítorí pé àwọn NP tí a fi omi ṣan tí kò sí mannitol fẹ́rẹ̀ẹ́ pa agbára ìfàmọ́ra sẹ́ẹ̀lì mọ́ pátápátá ti àwọn NP tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ ṣe. Àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé àwọn nanoparticles insulin gbígbẹ tí a pèsè nípasẹ̀ gbígbẹ ìfàmọ́ra láìsí mannitol ló dára jùlọ fún ṣíṣe àtúnṣe sí àwọn fọọmu ìwọ̀n mìíràn tí kò ní omi, bíi àwọn tábìlẹ́ẹ̀tì ẹnu tàbí àwọn fíìmù bioadhesive.
Nítorí àwọn ìṣòro ohun-ìní ọpọlọ, àwọn ìwádìí tí a ṣẹ̀dá àti/tàbí tí a ṣàyẹ̀wò nígbà ìwádìí yìí kò sí ní gbangba, ṣùgbọ́n wọ́n wà láti ọ̀dọ̀ àwọn òǹkọ̀wé tí ó bá béèrè fún wọn.
Kagan, A. Àtọ̀gbẹ Iru 2: Ìpilẹ̀ṣẹ̀ àwùjọ àti ìmọ̀ sáyẹ́ǹsì, àwọn ìṣòro ìṣègùn, àti àwọn àbájáde fún àwọn aláìsàn àti àwọn mìíràn. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Ìdàgbàsókè ìdènà insulin: Ǹjẹ́ a lè lo oògùn láti ẹnu báyìí? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Awọn ilọsiwaju tuntun ninu awọn eto ifijiṣẹ liposome ti a fi insulin sinu ẹnu fun itọju àtọgbẹ.Interpretation.J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).