Ẹ ṣeun fún ṣíbẹ̀wò sí Nature.com. Ẹ̀yà ẹ̀rọ aṣàwárí tí ẹ ń lò ní àtìlẹ́yìn CSS díẹ̀. Fún àwọn àbájáde tó dára jùlọ, a gbà yín nímọ̀ràn pé kí ẹ lo ẹ̀yà tuntun ti ẹ̀rọ aṣàwárí yín (tàbí kí ẹ má ṣe pa Ìbáramu Ipò nínú Internet Explorer mọ́). Ní ​​báyìí ná, láti rí i dájú pé àtìlẹ́yìn ń lọ lọ́wọ́, a ń fi ojú òpó náà hàn láìsí ìrísí tàbí JavaScript.
A lo Propionic acid (PPA) lati ṣe iwadi ipa ti iṣẹ-ṣiṣe mitochondrial ninu awọn rudurudu idagbasoke ọpọlọ gẹgẹbi aisan autism spectrum. A mọ PPA lati da biogeneti mitochondrial, iṣelọpọ, ati iyipada duro. Sibẹsibẹ, awọn ipa ti PPA lori awọn dynamics mitochondrial, fission ati fusion si tun wa ni iṣoro nitori iseda akoko ti o nira ti awọn ilana wọnyi. Nibi, a lo awọn imuposi aworan oniyemeji afikun lati ṣe iwadii bi PPA ṣe ni ipa lori ultrastructure mitochondrial, morphology, ati dynamics ninu awọn sẹẹli SH-SY5Y ti o dabi neuron. PPA (5 mM) fa idinku pataki ni agbegbe mitochondrial (p < 0.01), iwọn ila opin Feret ati circumference (p < 0.05), ati agbegbe 2 (p < 0.01). Ayẹwo Mitochondrial event locator fihan ilosoke pataki (p < 0.05) ninu awọn iṣẹlẹ fission ati fusion, nitorinaa mimu iduroṣinṣin ti nẹtiwọọki mitochondrial duro labẹ awọn ipo wahala. Ní àfikún, ìfarahàn mRNA ti cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) àti OPA1 (p < 0.05) dínkù gidigidi. 01). Èyí ṣàfihàn àtúnṣe ìrísí mitochondrial, biogenesis àti dynamics láti máa ṣiṣẹ́ lábẹ́ àwọn ipò àárẹ̀. Àwọn ìwádìí wa fúnni ní òye tuntun nípa àwọn ipa ti PPA lórí mitochondrial dynamics àti láti tẹnu mọ́ àǹfààní àwọn ọ̀nà àwòrán fún kíkẹ́kọ̀ọ́ àwọn ọ̀nà ìlànà dídíjú tí ó níí ṣe pẹ̀lú àwọn ìdáhùn àárẹ̀ mitochondrial.
Mitochondria jẹ́ àwọn olùkópa pàtàkì nínú onírúurú iṣẹ́ sẹ́ẹ̀lì ju ipa tí wọ́n ń kó nínú iṣẹ́ agbára àti ìṣẹ̀dá ara lọ. Ìṣẹ̀dá ara Mitochondria jẹ́ olùṣàkóso pàtàkì fún àmì calcium, ìṣẹ̀dá ara àti redox homeostasis, àmì ìgbóná ara, àwọn àtúnṣe epigenetic, ìdàgbàsókè sẹ́ẹ̀lì, ìyàtọ̀ àti ikú sẹ́ẹ̀lì tí a ṣètò. Ní pàtàkì, ìṣẹ̀dá ara mitochondrial ṣe pàtàkì fún ìdàgbàsókè sẹ́ẹ̀lì, ìwàláàyè àti iṣẹ́, ó sì ní ipa púpọ̀ nínú onírúurú ìfarahàn ti neuropathology2,3,4.
Láàárín ọdún mẹ́wàá tó kọjá, ipò ìṣiṣẹ́ ara ti farahàn gẹ́gẹ́ bí olùṣàkóso àárín ti neurogenesis, ìyàtọ̀, ìdàgbàsókè àti plasticity5,6. Láìpẹ́ yìí, ìrísí ara mitochondrial àti dynamics ti di àwọn ẹ̀yà pàtàkì pàtàkì ti mitosis, ìlànà ìṣiṣẹ́ ara tí ó ń tọ́jú adágún mitochondria tí ó ní ìlera láàrín àwọn sẹ́ẹ̀lì. Ìṣiṣẹ́ ara mitochondrial ni a ń ṣàkóso nípasẹ̀ àwọn ipa ọ̀nà tí ó díjú láti mitochondrial biogenesis àti bioenergetics sí mitochondrial fission, fusion, transport àti clearance7,8. Ìdàrú èyíkéyìí nínú àwọn ìlànà ìṣiṣẹ́ ara wọ̀nyí ń ba ìtọ́jú àwọn nẹ́ẹ̀tìwọ́ọ̀kì mitochondrial tí ó ní ìlera jẹ́, ó sì ní àwọn àbájáde iṣẹ́ gidi fún ìdàgbàsókè neuro9,10. Ní tòótọ́, àìṣedéédéé ti mitochondrial dynamics ni a rí nínú ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn àrùn ọpọlọ, neurodegenerative àti neurodevelopmental, pẹ̀lú àwọn àrùn autism spectrum (ASD)11,12.
ASD jẹ́ àrùn ọpọlọ tó yàtọ̀ síra pẹ̀lú ìṣètò ìṣẹ̀dá àti ìpìlẹ̀ epigenetic tó díjú. Kò sí àríyànjiyàn nípa ìbímọ ASD, ṣùgbọ́n ìpìlẹ̀ ìbímọ náà kò yé wa dáadáa. Àkójọ àwọn ìwádìí láti inú àwọn àpẹẹrẹ ìṣègùn, àwọn ìwádìí ìṣègùn, àti àwọn ìwádìí molecular multi-omics ń fúnni ní ẹ̀rí tó ń pọ̀ sí i nípa àìlera mitochondrial nínú ASD13,14. A ti ṣe àyẹ̀wò DNA methylation tó wọ́pọ̀ nínú àwùjọ àwọn aláìsàn pẹ̀lú ASD tẹ́lẹ̀, a sì ṣàwárí àwọn jiini methylated tó yàtọ̀ síra tí wọ́n tò pọ̀ ní ọ̀nà mitochondrial metabolic pathways15. Lẹ́yìn náà, a ròyìn ìyàtọ̀ methylation ti àwọn olùṣàkóso central ti mitochondrial biogenesis àti dynamics, èyí tí ó ní í ṣe pẹ̀lú iye mtDNA tí ó pọ̀ sí i àti ìyípadà ìṣẹ̀dá urinary ní ASD16. Àwọn ìwádìí wa ń fúnni ní ẹ̀rí tó ń pọ̀ sí i pé mitochondrial dynamics àti homeostasis ń kó ipa pàtàkì nínú pathophysiology ti ASD. Nítorí náà, mímú òye mechanistic nípa ìbáṣepọ̀ láàárín mitochondrial dynamics, morphology, àti function pọ̀ sí i jẹ́ ibi-afẹ́de pàtàkì ti ìwádìí tó ń lọ lọ́wọ́ sí àwọn àrùn neurological tí a fi àìlera mitochondrial secondary hàn.
Àwọn ọ̀nà ìṣiṣẹ́ molekulo ni a sábà máa ń lò láti kẹ́kọ̀ọ́ ipa àwọn jiini pàtó nínú àwọn ìdáhùn ìdààmú mitochondrial. Síbẹ̀síbẹ̀, ọ̀nà yìí lè ní ìdíwọ́ nípasẹ̀ ìwà onípele àti ìgbà díẹ̀ ti àwọn ọ̀nà ìdarí mitotic. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, ìfarahàn ìyàtọ̀ ti àwọn jiini mitochondrial jẹ́ àmì tí kò ṣe tààrà ti àwọn àyípadà iṣẹ́, pàápàá jùlọ nítorí pé iye àwọn jiini díẹ̀ ni a sábà máa ń ṣàyẹ̀wò. Nítorí náà, a ti dábàá àwọn ọ̀nà taara fún kíkẹ́kọ̀ọ́ iṣẹ́ mitochondrial àti bioenergetics17. Mitochondrial morphology ní ìbáṣepọ̀ tímọ́tímọ́ pẹ̀lú mitochondrial dynamics. Apẹrẹ Mitochondrial, ìsopọ̀, àti ìṣètò ṣe pàtàkì fún ìṣẹ̀dá agbára àti ìwàláàyè mitochondrial àti sẹ́ẹ̀lì5,18. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, onírúurú àwọn èròjà ti mitosis dojúkọ àwọn àyípadà nínú mitochondrial morphology, èyí tí ó lè ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí àwọn òpin wúlò ti àìṣiṣẹ́ mitochondrial àti pèsè ìpìlẹ̀ fún àwọn ìkẹ́kọ̀ọ́ mechanistic tí ó tẹ̀lé e.
A le ṣe akiyesi morphology mitochondrial taara nipa lilo transmission electron microscopy (TEM), gbigba ikẹkọ alaye ti ultrastructure cellular. TEM ṣe afihan morphology, apẹrẹ ati iṣeto ti mitochondrial cristae ni ipinnu ti mitochondria kọọkan, dipo gbigbekele nikan lori transcription jiini, ikosile amuaradagba tabi awọn paramita iṣẹ mitochondrial ninu awọn olugbe sẹẹli17,19,20. Ni afikun, TEM ṣe iranlọwọ fun ikẹkọ ti awọn ibaraenisepo laarin mitochondria ati awọn organelles miiran, gẹgẹbi endoplasmic reticulum ati autophagosomes, eyiti o ṣe awọn ipa pataki ninu iṣẹ mitochondrial ati homeostasis21,22. Nitorinaa, eyi jẹ ki TEM jẹ aaye ibẹrẹ ti o dara fun ikẹkọ iṣẹ mitochondrial ṣaaju ki o to dojukọ awọn ipa-ọna tabi awọn jiini kan pato. Bi iṣẹ mitochondrial ṣe n di pataki si neuropathy, iwulo wa ni gbangba lati ni anfani lati ṣe iwadi morphology mitochondrial ati dynamics taara ati ni iwọn ni awọn awoṣe neuronal in vitro.
Nínú àpilẹ̀kọ yìí, a ṣe àyẹ̀wò ìṣiṣẹ́ mitochondrial nínú àwòṣe neuronal ti àìṣiṣẹ́ mitochondrial nínú àrùn autism spectrum. A ti ròyìn tẹ́lẹ̀ pé ìyàtọ̀ methylation ti propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) wà nínú ASD15, èyí tí ó jẹ́ ìpín kan nínú enzyme mitochondrial propionyl-CoA carboxylase PCC. Àìṣiṣẹ́ PCC ni a mọ̀ pé ó ń fa ìkójọpọ̀ majele ti àwọn propionyl derivatives, títí kan propionic acid (PPA)23,24,25. A ti fihàn pé PPA ń ba ìṣiṣẹ́ neuronal jẹ́ àti yí ìwà padà ní vivo ó sì jẹ́ àwòṣe ẹranko tí a ti fìdí múlẹ̀ fún kíkẹ́kọ̀ọ́ àwọn ìlànà neurodevelopment tí ó ní ipa nínú ASD26,27,28. Ní àfikún, a ti ròyìn pé PPA ń ba agbára membrane mitochondrial jẹ́, biogenesis àti breathability in vitro, a sì ti lò ó ní gbogbogbò láti ṣe àwòṣe àìṣiṣẹ́ mitochondrial nínú neurons29,30. Síbẹ̀síbẹ̀, ipa àìṣiṣẹ́ mitochondrial tí PPA ń fà lórí morphology àti dynamics mitochondrial kò tíì yé wa dáadáa.
Ìwádìí yìí lo àwọn ọ̀nà ìṣàfihàn tó ṣe àfikún láti ṣe ìwọ̀n ipa tí PPA ní lórí ìrísí ara mitochondrial, ìrísí ara, àti iṣẹ́ nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y. Àkọ́kọ́, a ṣe àgbékalẹ̀ ọ̀nà TEM kan láti fojú inú wo àwọn ìyípadà nínú ìrísí ara mitochondrial àti ultrastructure17,31,32. Nítorí ìrísí ara mitochondria33, a tún lo ìṣàyẹ̀wò ìṣẹ̀lẹ̀ mitochondrial localizer (MEL) láti ṣe ìwọ̀n àwọn ìyípadà nínú ìwọ́ntúnwọ̀nsì láàrín àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ fission àti fusion, nọ́mbà mitochondrial àti ìwọ̀n lábẹ́ ìdààmú PPA. Níkẹyìn, a ṣe àyẹ̀wò bóyá ìrísí ara mitochondrial àti ìrísí ara mitochondrial ní í ṣe pẹ̀lú àwọn ìyípadà nínú ìfìhàn àwọn jiini tí ó ní í ṣe pẹ̀lú biogenesis, fission, àti fusion. Ní àpapọ̀, àwọn ìwádìí wa ṣe àfihàn ìpèníjà ti ṣíṣàlàyé ìṣòro àwọn ọ̀nà tí ó ń ṣàkóso ìrísí ara mitochondrial. A tẹnu mọ́ àǹfààní TEM nínú kíkẹ́kọ̀ọ́ ìrísí ara mitochondrial gẹ́gẹ́ bí ìpele ìdàpọ̀ tí a lè ṣe àyẹ̀wò ti mitosis nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y. Ní àfikún, a tẹnu mọ́ pé àwọn ìwádìí TEM ń fúnni ní ìwífún tí ó níye jùlọ nígbà tí a bá so pọ̀ mọ́ àwọn ìwádìí ìṣàfihàn tí ó tún ń gba àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ oníyẹ̀mí ní ìdáhùn sí ìdààmú ìṣiṣẹ́ ara. Àfikún ìṣàfihàn àwọn ìlànà ìlànà molikula tí ó ń ṣètìlẹ́yìn fún mitosis sẹ́ẹ̀lì neuronal lè fúnni ní òye pàtàkì nípa ẹ̀yà mitochondrial ti ètò iṣan ara àti àwọn àrùn neurodegenerative.
Láti fa wahala mitochondrial, a fi PPA tọ́jú àwọn sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y nípa lílo 3 mM àti 5 mM sodium propionate (NaP). Kí TEM tó dé, a fi àmì ìdánimọ̀ cryogenic ṣe àpẹẹrẹ nípa lílo didi àti dídì gíga (Àwòrán 1a). A ṣe àgbékalẹ̀ ọ̀nà ìwádìí àwòrán mitochondrial aládàáṣe láti wọn àwọn àmì morphological mẹ́jọ ti àwọn ènìyàn mitochondrial lórí àwọn àtúnṣe ẹ̀dá mẹ́ta. A rí i pé ìtọ́jú PPA yí àwọn àmì mẹ́rin padà ní pàtàkì: agbègbè 2, agbègbè, àyíká, àti ìlà Feret (Àwòrán 1b–e). Agbègbè 2 dínkù ní pàtàkì pẹ̀lú ìtọ́jú PPA 3 mM àti 5 mM (p = 0.0183 àti p = 0.002, lẹ́sẹẹsẹ) (Àwòrán 1b), nígbà tí agbègbè (p = 0.003), àyíká (p = 0.0106) àti ìlà Feret gbogbo wọn ti dínkù ní pàtàkì. Ìdínkù pàtàkì kan wà (p = 0.0172) nínú ẹgbẹ́ ìtọ́jú 5 mM ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìdarí (Àwòrán 1c–e). Àwọn ìdínkù pàtàkì nínú agbègbè àti àyíká fihàn pé àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a fi 5 mM PPA tọ́jú ní mitochondria kékeré, tí ó yípo jù, àti pé mitochondria wọ̀nyí kò gùn ju àwọn tí ó wà nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì ìṣàkóso lọ. Èyí tún bá ìdínkù pàtàkì mu nínú ìwọ̀n Feret, paramita òmìnira tí ó ń fihàn ìdínkù nínú ijinna tí ó tóbi jùlọ láàrín àwọn etí patiku. A ṣe àkíyèsí àwọn àyípadà nínú ultrastructure ti cristae: cristae di èyí tí ó fihàn kedere lábẹ́ ipa ti wahala PPA (Àwòrán 1a, panel B). Síbẹ̀síbẹ̀, kìí ṣe gbogbo àwọn àwòrán ló ṣe àfihàn ultrastructure ti cristae ní kedere, nítorí náà a kò ṣe àgbéyẹ̀wò oníwọ̀n ti àwọn àyípadà wọ̀nyí. Àwọn dátà TEM wọ̀nyí lè ṣàfihàn àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ mẹ́ta tí ó ṣeéṣe: (1) PPA mú kí ìfọ́pọ̀ pọ̀ sí i tàbí kí ó dí ìfọ́pọ̀ lọ́wọ́, tí ó ń fa kí mitochondria tí ó wà tẹ́lẹ̀ dínkù ní ìwọ̀n; (2) biogenesis tí ó ti mú dara síi ṣẹ̀dá mitochondria tuntun, kékeré tàbí (3) ń fa àwọn ètò méjèèjì ní àkókò kan náà. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé TEM kò le ṣe ìyàtọ̀ sí àwọn ipò wọ̀nyí, àwọn àyípadà morphological pàtàkì fihàn àwọn àyípadà nínú homeostasis mitochondrial àti dynamics lábẹ́ wahala PPA. Lẹ́yìn náà a ṣe àwárí àwọn pàrámítà afikún láti ṣe àpèjúwe àwọn dynamics wọ̀nyí àti àwọn ìlànà tí ó lè wà lábẹ́ wọn síwájú sí i.
Àtúnṣe àwọ̀ Propionic acid (PPA) sí ìrísí mitochondrial. (a) Àwọn àwòrán onímọ̀ nípa ìfàsẹ́yìn electron (TEM) tí ó fihàn pé ìwọ̀n mitochondrial ń dínkù àti mitochondria ń dínkù sí i pẹ̀lú ìtọ́jú PPA tí ó ń pọ̀ sí i; 0 mM (tí a kò tọ́jú), 3 mM àti 5 mM, lẹ́sẹẹsẹ. Àwọn ọfà pupa ń fihàn mitochondria. (b–e) Àwọn sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y tí a fi PPA tọ́jú fún wákàtí 24 ni a pèsè fún TEM àti àwọn àbájáde ni a ṣe àyẹ̀wò nípa lílo Fiji/ImageJ. Mẹ́rin nínú àwọn ìpínrọ̀ mẹ́jọ náà fi ìyàtọ̀ pàtàkì hàn láàrín àwọn sẹ́ẹ̀lì ìṣàkóso (tí a kò tọ́jú, 0 mM PPA) àti àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a tọ́jú (3 mM àti 5 mM PPA). (b) Agbègbè 2, (c) Agbègbè, (d) Àyíká, (e) Ìwọ̀n Feret. A lo ìṣàyẹ̀wò ìyàtọ̀ ọ̀nà kan (ìṣàkóso vs. ìtọ́jú) àti ìdánwò ìfiwéra púpọ̀ ti Dunnett láti pinnu àwọn ìyàtọ̀ pàtàkì (p < 0.05). Àwọn àmì dátà dúró fún iye mitochondrial apapọ fún sẹ́ẹ̀lì kọ̀ọ̀kan, àti àwọn ọ̀pá àṣìṣe dúró fún àròpín ± SEM. Dátà tí a fihàn dúró fún n = 3, ó kéré tán àwọn sẹ́ẹ̀lì 24 fún àtúnṣe kọ̀ọ̀kan; Àròpọ̀ àwòrán 266 ni a ṣàyẹ̀wò; * fi hàn pé p < 0.05, ** fi hàn pé p < 0.01.
Láti túbọ̀ ṣe àpèjúwe bí mitochondria ṣe ń dáhùn sí PPA, a fi tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) ṣe àwọ̀ mitochondria, a sì lo microscopy time-lapse àti MEL analysis láti fi ṣe àgbékalẹ̀ mitochondria àti láti fi ṣe àyẹ̀wò rẹ̀ lẹ́yìn wákàtí 24 ní 3 àti 5 mM PPA. Ìtọ́jú àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ fission àti fusion. (Àwòrán 2a). Lẹ́yìn ìwádìí MEL, a tún ṣe àyẹ̀wò mitochondria láti fi ṣe àyẹ̀wò iye àwọn ètò mitochondrial àti ìwọ̀n wọn lápapọ̀. A rí ìbísí kékeré ṣùgbọ́n pàtàkì nínú iye àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ fission tó ń ṣẹlẹ̀ ní 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] ní ìfiwéra pẹ̀lú fission [5.6 ± 0.3 (p < 0.05) )] àti fusion [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] àti fusion [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ <0.05)] pọ̀ sí i ní 5 mM ní ìfiwéra pẹ̀lú ìṣàkóso (Àwòrán 3b). Iye mitochondria pọ si ni pataki ni 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] ati 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Fig. 3c), lakoko ti iwọn apapọ ti eto mitochondrial kọọkan ko yipada (Fig. 3c). 3d). Ni apapọ, eyi daba pe atunṣe ti awọn agbara mitochondrial ṣiṣẹ bi idahun isanpada ti o ṣetọju iduroṣinṣin ti nẹtiwọọki mitochondrial ni aṣeyọri. Pipọsi ninu nọmba awọn iṣẹlẹ fission ni 3 mM PPA daba pe ilosoke ninu nọmba mitochondrial jẹ apakan nitori fission mitochondrial, ṣugbọn nitori pe iwọn apapọ mitochondrial ko yipada ni pataki, a ko le yọkuro biogenesis gẹgẹbi idahun isanpada afikun. Sibẹsibẹ, awọn data wọnyi baamu pẹlu awọn ẹya mitochondrial kekere, yika ti TEM ṣe akiyesi ati tun ṣafihan awọn iyipada pataki ninu awọn agbara mitochondrial ti PPA fa.
Àsìdì Propionic (PPA) ń fa àtúnṣe mitochondrial onígbà díẹ̀ láti pa ìwà títọ́ mọ́. A gbin àwọn sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y, a fi 3 àti 5 mM PPA tọ́jú fún wákàtí 24, a sì fi àwọ̀ TMRE àti Hoechst 33342 bò wọ́n, lẹ́yìn náà ni a fi àyẹ̀wò MEL ṣe àtúnṣe. (a) Àwọn àwòrán microscopy onígbà díẹ̀ tí ó ń ṣàfihàn àwọ̀ àti àwọn àsọtẹ́lẹ̀ agbára onígbà díẹ̀ tí a ti ṣe àfihàn ní àkókò 2 (t2) fún ipò kọ̀ọ̀kan. Àwọn agbègbè tí a yàn tí a tọ́ka sí nínú àwòrán onígbà méjì kọ̀ọ̀kan ni a mú sunwọ̀n sí i, a sì fi hàn ní 3D ní àkókò mẹ́ta ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ (t1-t3) láti ṣàfihàn agbára lórí àkókò; àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ ìfọ́pọ̀ ni a fi àwọ̀ ewé ṣe àfihàn; àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ ìfọ́pọ̀ ni a fi àwọ̀ ewé ṣe àfihàn. A fi hàn ní pupa. (b) Iye apapọ ti awọn ìṣẹ̀lẹ̀ onígbà díẹ̀ fún ipò kọ̀ọ̀kan. (c) Iye apapọ ti awọn ètò mitochondrial fún sẹ́ẹ̀lì kan. (d) Iwọn apapọ (µm3) ti ètò mitochondrial kọ̀ọ̀kan fún sẹ́ẹ̀lì kan. Dáta tí a fi hàn jẹ́ aṣojú ti n = 15 sẹ́ẹ̀lì fún ẹgbẹ́ ìtọ́jú kan. Àwọn ọ̀pá àṣìṣe tí a fi hàn dúró fún ìwọ̀n ± SEM, ọ̀pá ìwọ̀n = 10 μm, * p < 0.05.
Àsíìdì Propionic (PPA) máa ń fa ìdènà ìkọ̀wé àwọn jínì tí ó níí ṣe pẹ̀lú agbára mitochondrial. A fi 3 àti 5 mM PPA tọ́jú àwọn sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y fún wákàtí 24. A ṣe ìwọ̀n jínì tí ó níí ṣe pẹ̀lú RT-qPCR, a sì ṣe àtúnṣe sí B2M. Àwọn jínì biogenesis Mitochondrial (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 àti (d) NFE2L2. Àwọn jínì fusion àti fission Mitochondrial (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 àti (i) DRP1. A dán àwọn ìyàtọ̀ pàtàkì (p < 0.05) wò nípa lílo ANOVA ọ̀nà kan (ìṣàkóso vs. ìtọ́jú) àti ìdánwò ìfiwéra púpọ̀ ti Dunnett: * fihàn p < 0.05, ** fihàn p < 0.01, àti **** fihàn p < 0.0001. Àwọn ọ̀pá dúró fún ìfarahàn àròpọ̀ ± SEM. Àwọn ìwádìí tí a fihàn dúró fún n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), àti n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) àwọn ohun tí ó ń ṣe àtúnṣe ẹ̀dá.
Àwọn ìwádìí láti inú àyẹ̀wò TEM àti MEL papọ̀ fihàn pé PPA ń yí ìrísí àti agbára mitochondrial padà. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn ọ̀nà ìwòran wọ̀nyí kò fúnni ní òye nípa àwọn ìlànà ìpìlẹ̀ tí ń darí àwọn ìlànà wọ̀nyí. Nítorí náà, a ṣe àyẹ̀wò ìfihàn mRNA ti àwọn olùṣàkóso pàtàkì mẹ́sàn-án ti agbára mitochondrial, biogenesis, àti mitosis ní ìdáhùn sí ìtọ́jú PPA. A ṣe ìṣírò ìwọ̀n myeloma oncogene cell (cMYC), nuclear respiratory factor (NRF1), mitochondrial transcription factor 1 (TFAM), NFE2-like transcription factor BZIP (NFE2L2), gastrin-like protein 2 (STOML2), optic nerve atrophy 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) àti dynamin-related protein 1 (DRP1) lẹ́yìn wákàtí 24 ti ìtọ́jú pẹ̀lú 3 mM àti 5 mM PPA. A ṣe akiyesi 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 ati p < 0.0001, lẹsẹsẹ) ati 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) itọju PPA. (Àwòrán 3a–c). Idinku ninu ikosile mRNA da lori iwọn lilo: ikosile cMYC, NRF1 ati TFAM dinku nipasẹ akoko 5.7, 2.6 ati 1.9 ni 3 mM, lẹsẹsẹ, ati nipasẹ akoko 11.2, 3 ati 2.2 ni 5 mM. Ni idakeji, gene redox biogenesis central NFE2L2 ko yipada ni eyikeyi ifọkansi ti PPA, botilẹjẹpe a ṣe akiyesi aṣa ti o da lori iwọn lilo kanna ti idinku ikosile (Àwòrán 3d).
A tún ṣe àyẹ̀wò ìfarahàn àwọn jínì àgbékalẹ̀ tí ó níí ṣe pẹ̀lú ìṣètò ìfọ́pọ̀ àti ìfọ́pọ̀. A gbàgbọ́ pé STOML2 níí ṣe pẹ̀lú ìfọ́pọ̀, mitophagy àti biogenesis, ìfarahàn rẹ̀ sì dínkù gidigidi (p < 0.0001) nípa 3 mM (ìyípadà ìlọ́po méjì) àti 5 mM (ìyípadà ìlọ́po méjì) PPA (Àwòrán 1). 3d). Bákan náà, ìfarahàn jínì àgbékalẹ̀ OPA1 dínkù ní 3 mM (ìyípadà ìlọ́po méjì) àti 5 mM (ìyípadà ìlọ́po méjì) PPA (p = 0.006 àti p = 0.0024, lẹ́sẹẹsẹ) (Àwòrán 3f). Síbẹ̀síbẹ̀, a kò rí ìyàtọ̀ pàtàkì nínú ìfarahàn àwọn jínì àgbékalẹ̀ MFN1, MFN2 tàbí ìfọ́pọ̀ DRP1 lábẹ́ ìdààmú PPA fún wákàtí 24 (Àwòrán 3g–i). Ni afikun, a rii pe awọn ipele ti awọn amuaradagba idapọ mẹrin ati fission (OPA1, MFN1, MFN2 ati DRP1) ko yipada labẹ awọn ipo kanna (Fig. 4a–d). O ṣe pataki lati ṣe akiyesi pe awọn data wọnyi ṣe afihan aaye kan ni akoko ati pe o le ma ṣe afihan awọn iyipada ninu ikosile amuaradagba tabi awọn ipele iṣẹ lakoko awọn ipele ibẹrẹ ti wahala PPA. Sibẹsibẹ, awọn idinku pataki ninu ikosile ti cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, ati OPA1 fihan idinku transcriptional pataki ti iṣelọpọ mitochondrial, biogenesis, ati dynamics. Ni afikun, awọn data wọnyi ṣe afihan anfani ti awọn imuposi aworan lati ṣe iwadi taara awọn iyipada ipo-ipari ninu iṣẹ mitochondrial.
Ipele amuaradagba idapọ ati fission factor ko yipada lẹhin itọju propionic acid (PPA). A fi PPA 3 ati 5 mM fun awọn sẹẹli SH-SY5Y fun wakati 24. A ṣe iwọn ipele amuaradagba nipasẹ itupalẹ Western blot, ati awọn ipele ikosile ni a ṣe deede si amuaradagba lapapọ. A fihan ifihan amuaradagba apapọ ati awọn abawọn Western ti afojusun ati apapọ amuaradagba. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Awọn ọpa duro fun apapọ ± SEM, ati data ti a fihan jẹ aṣoju ti n = 3 awọn ẹda ti ara. A ṣe awọn afiwe pupọ (p < 0.05) nipa lilo itupalẹ ọna kan ti iyatọ ati idanwo Dunnett. Geli ati blot atilẹba ni a fihan ninu Aworan S1.
Àìlera mitochondrial níí ṣe pẹ̀lú àwọn àrùn oníṣẹ́ẹ́pọ̀ láti àwọn àrùn ìṣiṣẹ́ ara, àrùn ọkàn àti iṣan sí àwọn àrùn ọpọlọ1,10. Ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn àrùn neurodegenerative àti neurodegenerative ni a so mọ́ àìlera mitochondrial, èyí tí ó ń fi hàn pé àwọn organelles wọ̀nyí ṣe pàtàkì ní gbogbo ìgbésí ayé ọpọlọ. Àwọn àrùn wọ̀nyí ní àrùn Parkinson, àrùn Alzheimer àti ASD3,4,18. Síbẹ̀síbẹ̀, lílo àsopọ ọpọlọ láti kẹ́kọ̀ọ́ àwọn àrùn wọ̀nyí ṣòro, pàápàá jùlọ ní ìpele ẹ̀rọ, tí ó mú kí àwọn ètò àwòṣe cellular jẹ́ àṣàyàn pàtàkì. Nínú ìwádìí yìí, a lo ètò àwòṣe cellular tí ó ń lo àwọn sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y tí a tọ́jú láti ṣe àtúnṣe àìlera mitochondrial tí a rí nínú àwọn àrùn neuroneur, pàápàá jùlọ àwọn àrùn autism spectrum. Lílo àwòṣe PPA yìí láti kẹ́kọ̀ọ́ nípa àwọn ìṣiṣẹ́ mitochondrial nínú àwọn neuron lè fúnni ní òye nípa ìdí ti ASD.
A ṣe àwárí ìṣeéṣe lílo TEM láti wo àwọn ìyípadà nínú ìrísí mitochondrial. Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé a gbọ́dọ̀ lo TEM dáadáa láti mú kí ó ṣiṣẹ́ dáadáa. Ìmúra àwọn àpẹẹrẹ cryo-specimens gba ààyè fún ìtọ́jú tó dára jù fún àwọn ìrísí neuronal nípa ṣíṣe àtúnṣe àwọn èròjà sẹ́ẹ̀lì ní àkókò kan náà àti dídín ìṣẹ̀dá àwọn ohun èlò ìṣẹ̀dá kù34. Ní ìbámu pẹ̀lú èyí, a ṣe àkíyèsí pé àwọn sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y tí ó dàbí neuron ní àwọn ẹ̀yà ara kékeré tí ó wà ní ìsàlẹ̀ àti mitochondria gígùn (Àwòrán 1a). Èyí ṣe àfihàn àǹfààní àwọn ọ̀nà ìpalẹ̀mọ́ cryogenic fún kíkẹ́kọ̀ọ́ ìrísí mitochondrial nínú àwọn àpẹẹrẹ sẹ́ẹ̀lì neuronal. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn ìwọ̀n ìrísí ṣe pàtàkì fún ìṣàyẹ̀wò ohun tí a lè fojú rí ti dátà TEM, kò sí ìfohùnṣọ̀kan lórí àwọn pàrámítà pàtó tí ó yẹ kí a wọ̀n láti jẹ́rìí sí àwọn ìyípadà ìrísí mitochondrial. Ní ìbámu pẹ̀lú ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ìwádìí tí wọ́n ti ṣe àyẹ̀wò ìrísí mitochondrial ní ìwọ̀n ìrísí17,31,32, a ṣe àgbékalẹ̀ ọ̀nà ìṣàyẹ̀wò àwòrán mitochondrial aládàáṣe kan tí ó wọn àwọn pàrámítà morphological mẹ́jọ, èyí ni: agbègbè, agbègbè2, ìpíndọ́gba apá, àyíká, yíká, ìwọ̀n, ìwọ̀n , ìlà feret. àti yíká.
Láàrin wọn, PPA dín agbègbè 2, agbègbè, àyíká, àti ìwọ̀n Feret kù ní pàtàkì (Àwòrán 1b–e). Èyí fihàn pé mitochondria di kékeré àti yípo sí i, èyí tí ó bá àwọn ìwádìí ìṣáájú tí ó fi ìdínkù nínú agbègbè mitochondrial hàn lẹ́yìn wákàtí 72 ti wahala mitochondrial tí PPA30 fà. Àwọn àmì ìrísí wọ̀nyí lè fi ìfọ́ mitochondrial hàn, ìlànà tí ó ṣe pàtàkì láti yan àwọn èròjà tí ó bàjẹ́ láti inú nẹ́tíwọ́ọ̀kì mitochondrial láti gbé ìbàjẹ́ wọn lárugẹ nípasẹ̀ mitophagy35,36,37. Ní ọwọ́ kejì ẹ̀wẹ̀, ìdínkù nínú ìwọ̀n mitochondrial lápapọ̀ lè níí ṣe pẹ̀lú biogenesis tí ó pọ̀ sí i, èyí tí ó ń yọrí sí ìṣẹ̀dá mitochondria kékeré tí ó ṣẹ̀ṣẹ̀ bẹ̀rẹ̀. Ìfọ́ tàbí biogenesis tí ó pọ̀ sí i dúró fún ìdáhùn ìsanpadà láti pa mitosis mọ́ lòdì sí wahala mitochondrial. Síbẹ̀síbẹ̀, a kò le yọ ìdàgbàsókè mitochondrial tí ó dínkù, ìfọ́pọ̀ tí ó bàjẹ́, tàbí àwọn ipò mìíràn kúrò.
Bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn àwòrán gíga tí TEM ṣẹ̀dá ń jẹ́ kí a mọ àwọn ànímọ́ ìrísí ní ìpele mitochondria kọ̀ọ̀kan, ọ̀nà yìí ń mú àwọn àwòrán onípele méjì jáde ní àkókò kan ṣoṣo. Láti kẹ́kọ̀ọ́ nípa àwọn ìdáhùn oníyípadà sí ìdààmú ìṣiṣẹ́ ara, a fi TMRE ṣe àwọ̀ mitochondria náà, a sì lo microscopy àkókò-láìpẹ́ pẹ̀lú ìwádìí MEL, èyí tí ó fún ni láàyè láti wo àwọn àyípadà nínú nẹ́tíwọ́ọ̀kì mitochondrial ní àkókò 33,38. A rí àwọn àyípadà díẹ̀díẹ̀ ṣùgbọ́n pàtàkì nínú ìṣiṣẹ́ mitochondrial lábẹ́ ìdààmú PPA (Àwòrán 2). Ní ​​3 mM, iye àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ fission pọ̀ sí i ní pàtàkì, nígbà tí àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ fusion dúró gẹ́gẹ́ bí ó ti wà nínú ìṣàkóso. A rí ìbísí nínú iye àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ fission àti fusion ní 5 mM PPA, ṣùgbọ́n àwọn àyípadà wọ̀nyí fẹ́rẹ̀ẹ́ jẹ́ ìwọ̀n, èyí tí ó fihàn pé fission àti fusion kinetikis dé ìwọ̀n ní àwọn ìfọ́síwájú gíga (Àwòrán 2b). Ìwọ̀n mitochondrial tó wọ́pọ̀ kò yí padà ní 3 àti 5 mM PPA, èyí tí ó fihàn pé a pa ìdúróṣinṣin nẹ́tíwọ́ọ̀kì mitochondrial mọ́ (Àwòrán 2d). Èyí fi agbára àwọn nẹ́ẹ̀tìwọ́ọ̀kì mitochondrial onígbà díẹ̀ hàn láti dáhùn sí ìdààmú ìṣiṣẹ́ ara láti mú homeostasis ṣiṣẹ́ dáadáa láìsí pé ó fa ìpínyà nẹ́ẹ̀tìwọ́ọ̀kì. Ní 3 mM PPA, ìbísí nínú ìfọ́sí tó láti gbé ìyípadà sí ìwọ́ntúnwọ́nsì tuntun lárugẹ, ṣùgbọ́n àtúnṣe kinetic tó jinlẹ̀ ni a nílò láti dáhùn sí ìdààmú tí àwọn ìfọ́síwájú PPA tó ga jùlọ fà.
Iye mitochondria pọ si ni awọn ipele wahala PPA mejeeji, ṣugbọn iwọn mitochondria apapọ ko yipada ni pataki (Fig. 2c). Eyi le jẹ nitori ilosoke biogenesis tabi pipin ti o pọ si; sibẹsibẹ, ni aisi idinku pataki ninu iwọn mitochondria apapọ, o ṣee ṣe ki biosynthesis pọ si. Sibẹsibẹ, data ninu Fig 2 ṣe atilẹyin fun wiwa awọn ọna isanpada meji: ilosoke ninu nọmba awọn iṣẹlẹ fission, ni ibamu pẹlu igbesoke ti fission mitochondrial, ati ilosoke ninu nọmba awọn iṣẹlẹ, ni ibamu pẹlu biogenesis mitochondrial. Nikẹhin, isanpada dynamic fun wahala kekere le ni awọn ilana kanna ti o kan fission, fusion, biogenesis, ati mitophagy. Biotilẹjẹpe awọn onkọwe iṣaaju ti fihan pe PPA mu mitosis30,39 ati mitophagy29 pọ si, a pese ẹri fun atunṣe ti fission mitochondrial ati awọn agbara fusion ni idahun si PPA. Awọn data wọnyi jẹrisi awọn iyipada morphological ti TEM ṣe akiyesi ati pese oye siwaju si sinu awọn ilana ti o ni nkan ṣe pẹlu iṣẹ-ṣiṣe mitochondrial ti PPA fa.
Nítorí pé ìwádìí TEM tàbí MEL kò fi ẹ̀rí tààrà hàn nípa àwọn ìlànà ìṣàkóso jínì tó ń darí àwọn àyípadà ìrísí ara tí a rí, a ṣe àyẹ̀wò ìfihàn RNA ti àwọn jínì tó ní ipa nínú ìṣiṣẹ́ mitochondrial, biogenesis, àti dynamics. CMYC proto-oncogene jẹ́ kókó ìkọ̀wé tó ní ipa nínú ìṣàkóso mitochondria, glycolysis, amino acid àti fatty acid metabolism40. Ní àfikún, a mọ̀ pé cMYC ń ṣàkóso ìfihàn àwọn jínì mitochondrial tó fẹ́rẹ̀ẹ́ tó 600 tó ní ipa nínú ìkọ̀wé mitochondrial, ìtumọ̀, àti àkójọpọ̀ tó díjú, títí kan NRF1 àti TFAM41. NRF1 àti TFAM jẹ́ àwọn olùṣàkóso àárín méjì ti mitosis, tí wọ́n ń ṣiṣẹ́ ní ìsàlẹ̀ PGC-1α láti mú ìṣiṣẹ́ mtDNA ṣiṣẹ́. Ìlànà yìí ni a ń ṣiṣẹ́ nípasẹ̀ ìfìhàn cAMP àti AMPK ó sì ní ìmọ̀lára sí ìnáwó agbára àti ìṣiṣẹ́ ara. A tún ṣe àyẹ̀wò NFE2L2, olùṣàkóso redox ti mitochondrial biogenesis, láti pinnu bóyá ìyọrísí PPA lè jẹ́ ti ìdààmú oxidative.
Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ìfarahàn NFE2L2 kò yí padà, a rí ìdínkù tó dúró lórí ìwọ̀n ìfarahàn cMYC, NRF1 àti TFAM lẹ́yìn ìtọ́jú wákàtí mẹ́rìnlélógún pẹ̀lú 3 mM àti 5 mM PPA (Àwòrán 3a–c). A ti ròyìn ìdínkù ìfarahàn cMYC tẹ́lẹ̀ gẹ́gẹ́ bí ìdáhùn sí stress mitochondrial42, àti ní ọ̀nà mìíràn, ìdínkù ìfarahàn cMYC lè fa àìlera mitochondrial nípa ṣíṣe àtúnṣe ìṣàtúnṣe mitochondrial, ìsopọ̀mọ́ra nẹ́tíwọ́ọ̀kì, àti ìfọ́pọ̀ membrane43. Lóòótọ́, cMYC tún ń kópa nínú ìṣàkóso fission àti fusion42,43 ó sì jẹ́ mímọ̀ pé ó ń mú kí DRP1 phosphorylation àti ààyè mitochondrial pọ̀ sí i nígbà ìpín sẹ́ẹ̀lì44, àti láti ṣe àtúnṣe mitochondrial morphological nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì neuronal stem45. Ní tòótọ́, àwọn fibroblasts tí kò ní cMYC ń fi ìwọ̀n mitochondrial tí ó dínkù hàn, ní ìbámu pẹ̀lú àwọn àyípadà tí wahala PPA43 fà. Àwọn dátà wọ̀nyí ṣàfihàn ìbáṣepọ̀ tó dùn mọ́ni ṣùgbọ́n tí kò ṣe kedere láàrín cMYC àti mitochondrial dynamics, èyí tí ó ń pèsè àfojúsùn tó dùn mọ́ni fún àwọn ìkẹ́kọ̀ọ́ ọjọ́ iwájú nípa àtúnṣe PPA tí wahala fa.
Idinku NRF1 ati TFAM ba ipa cMYC mu gege bi olumulo transcriptional pataki. Awon data wonyi tun ba awon iwadi ti o ti se tele ninu awon sẹẹli akàn inu eniyan mu ti o fihan pe PPA dinku ifihan NRF1 mRNA ni wakati 22, eyi ti o ni nkan se pelu idinku ATP ati ilosoke ROS46. Awon onkọwe wonyi tun royin pe ifihan TFAM pọ si ni wakati 8.5 ṣugbọn o pada si awọn ipele ibẹrẹ ni wakati 22. Ni idakeji, Kim et al. (2019) fihan pe ifihan TFAM mRNA dinku ni pataki lẹhin wakati 4 ti wahala PPA ninu awọn sẹẹli SH-SY5Y; sibẹsibẹ, lẹhin wakati 72, ifihan amuaradagba TFAM pọ si ni pataki ati nọmba ẹda mtDNA pọ si ni pataki. Nitorinaa, idinku ninu nọmba awọn jiini biogenesis mitochondrial ti a ṣe akiyesi lẹhin wakati 24 ko yọkuro iṣeeṣe pe ilosoke ninu nọmba mitochondria ni nkan ṣe pẹlu imuṣiṣẹ ti biogenesis ni awọn aaye akoko iṣaaju. Àwọn ìwádìí tí a ti ṣe tẹ́lẹ̀ ti fihàn pé PPA ń mú kí PGC-1α mRNA àti amuaradagba pọ̀ sí i ní pàtàkì nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y ní wákàtí mẹ́rin àti ìṣẹ́jú 30, nígbà tí propionic acid ń mú kí mitochondrial biogenesis pọ̀ sí i nínú àwọn hepatocytes ọmọ màlúù nípasẹ̀ PGC-1α ní wákàtí méjìlá àti ìṣẹ́jú 39. Lóòótọ́, PGC-1α kì í ṣe olùṣàkóso ìkọ̀wé taara ti NRF1 àti TFAM nìkan, ṣùgbọ́n a ti fihàn pé ó ń ṣàkóso ìṣiṣẹ́ MFN2 àti DRP1 nípa ṣíṣàkóso fission àti fusion47. Ní àpapọ̀, èyí ń ṣe àfihàn ìsopọ̀mọ́ra tímọ́tímọ́ ti àwọn ìlànà tí ń ṣàkóso àwọn ìdáhùn ìsanpadà mitochondrial tí PPA ń fà. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, àwọn ìwádìí wa ń ṣe àfihàn àìṣedéédéé pàtàkì ti ìlànà ìkọ̀wé ti biogenesis àti ìṣiṣẹ́ ara lábẹ́ wahala PPA.
Àwọn jínì STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 àti DRP1 wà lára ​​àwọn olùṣàkóso àárín gbùngbùn ti fission mitochondrial, fusion àti dynamics37,48,49. Ọ̀pọ̀lọpọ̀ jínì mìíràn ló wà nínú mitochondrial dynamics, síbẹ̀síbẹ̀, a ti rí i tẹ́lẹ̀ pé STOML2, OPA1 àti MFN2 ní ìyàtọ̀ methylation nínú àwọn ẹgbẹ́ ASD,16 àti ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ìwádìí òmìnira ti ròyìn àwọn àyípadà nínú àwọn ohun èlò ìkọ̀wé wọ̀nyí ní ìdáhùn sí stress mitochondrial50,51. 52. Ìfarahàn OPA1 àti STOML2 dínkù gidigidi nípa ìtọ́jú 3 mM àti 5 mM PPA (Àwòrán 3e, f). OPA1 jẹ́ ọ̀kan lára ​​àwọn olùṣàkóso kilasika ti mitochondrial fusion nípasẹ̀ ìbáṣepọ̀ tààrà pẹ̀lú MFN1 àti 2 ó sì kó ipa nínú àtúnṣe cristae àti morphology mitochondrial53. Ipa pàtó ti STOML2 nínú mitochondrial dynamics kò tíì yé kedere, ṣùgbọ́n ẹ̀rí fihàn pé ó kó ipa nínú mitochondrial fusion, biogenesis, àti mitophagy.
STOML2 ní ipa nínú mímú ìsopọ̀mọ́ra atẹ́gùn mitochondrial àti ìṣẹ̀dá àwọn àkópọ̀ ẹ̀wọ̀n atẹ́gùn 54,55 àti pé ó ti fihàn pé ó yí àwọn ànímọ́ ìṣẹ̀dá ara àwọn sẹ́ẹ̀lì àrùn jẹjẹrẹ padà gidigidi56. Àwọn ìwádìí ti fihàn pé STOML2 ń gbé agbára àwọ̀ ara mitochondrial àti biogenesis lárugẹ nípasẹ̀ ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú BAN àti cardiolipin 55, 57, 58. Ní àfikún, àwọn ìwádìí aláìdádúró ti fihàn pé ìbáṣepọ̀ láàárín STOML2 àti PINK1 ń ṣe àkóso mitophagy59,60. Ní pàtàkì, a ti ròyìn STOML2 láti bá MFN2 ṣe ìbáṣepọ̀ tààrà àti láti mú kí ó dúró ṣinṣin, ó sì tún ń kó ipa pàtàkì nínú dídúró ṣinṣin àwọn isoforms OPA1 gígùn nípa dídínà protease tí ó jẹ́ olùṣe ìbàjẹ́ OPA1 53,61,62. Ìdínkù nínú ìfarahàn STOML2 tí a rí nínú àwọn ìṣe PPA lè mú kí àwọn protein ìfọ́pọ̀ wọ̀nyí ṣeéṣe fún ìbàjẹ́ nípasẹ̀ àwọn ipa ọ̀nà ubiquitin- àti proteasome-dependent48. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ipa pàtó tí STOML2 àti OPA1 kó nínú ìdáhùn tó lágbára sí PPA kò ṣe kedere, ìdínkù nínú ìfìhàn àwọn jínì ìfọ́pọ̀ wọ̀nyí (Àwòrán 3) lè ba ìwọ́ntúnwọ̀nsí láàrín ìfọ́pọ̀ àti ìfọ́pọ̀ jẹ́, kí ó sì yọrí sí ìdínkù ìwọ̀n mitochondrial (Àwòrán 3). 1).
Ní ọwọ́ kejì ẹ̀wẹ̀, ìfarahàn amuaradagba OPA1 kò yí padà lẹ́yìn wákàtí mẹ́rìnlélógún, nígbàtí ìpele mRNA àti amuaradagba ti MFN1, MFN2 tàbí DRP1 kò yí padà ní pàtàkì lẹ́yìn ìtọ́jú PPA (Àwòrán 3g-i, Àwòrán 4). Èyí lè fihàn pé kò sí ìyípadà nínú ìlànà àwọn ohun wọ̀nyí tí ó níí ṣe pẹ̀lú ìfọ́pọ̀ mitochondrial àti fission. Síbẹ̀síbẹ̀, ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé ọ̀kọ̀ọ̀kan àwọn jínì mẹ́rin wọ̀nyí ni a tún ń ṣàkóso nípasẹ̀ àwọn àtúnṣe posttranscriptional (PTMs) tí ó ń ṣàkóso ìṣiṣẹ́ amuaradagba. OPA1 ní àwọn ìyàtọ̀ splice mẹ́jọ mìíràn tí a pín sí wẹ́wẹ́ nínú mitochondria láti ṣe àwọn isoforms méjì tí ó yàtọ̀ síra 63. Ìwọ̀ntúnwọ̀nsì láàrín àwọn isoforms gígùn àti kúkúrú nígbẹ̀yìn-gbẹ́yín pinnu ipa ti OPA1 nínú ìfọ́pọ̀ mitochondrial àti ìtọ́jú mitochondrial network64. Iṣẹ́ DRP1 ni a ń ṣàkóso nípasẹ̀ calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) phosphorylation, nígbàtí ubiquitination àti SUMOylation65 ń ṣàkóso ìbàjẹ́ DRP1. Níkẹyìn, DRP1 àti MFN1/2 jẹ́ GTPases, nítorí náà ìṣiṣẹ́ lè ní ipa lórí ìwọ̀n ìṣẹ̀dá GTP nínú mitochondria 66. Nítorí náà, bó tilẹ̀ jẹ́ pé ìfarahàn àwọn amuaradagba wọ̀nyí dúró ṣinṣin, èyí lè má ṣe àfihàn ìṣiṣẹ́ amuaradagba tí kò yí padà tàbí ìbílẹ̀67,68. Ní tòótọ́, àwọn àkójọpọ̀ amuaradagba PTM tí ó wà tẹ́lẹ̀ sábà máa ń ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí ìlà ààbò àkọ́kọ́ tí ó ní ìdí láti ṣe àtúnṣe àwọn ìdáhùn wàhálà líle koko. Ní wíwà nínú wahala ìṣiṣẹ́ ara tí ó wà ní ìwọ̀nba nínú àwòṣe wa, ó ṣeé ṣe kí PTM mú kí ìṣiṣẹ́ ìfọ́pọ̀ àti àwọn amuaradagba fission pọ̀ sí i láti mú ìdúróṣinṣin mitochondrial padà tó láìsí pé ó nílò ìṣiṣẹ́ afikún ti àwọn jínì wọ̀nyí ní ìpele mRNA tàbí amuaradagba.
Ní àpapọ̀, àwọn ìwádìí tí a kọ sókè yìí tẹnu mọ́ ìlànà dídíjú àti ìgbẹ́kẹ̀lé àkókò ti ìrísí mitochondrial àti àwọn ìpèníjà ti ṣíṣàlàyé àwọn ọ̀nà wọ̀nyí. Láti kẹ́kọ̀ọ́ ìfarahàn jínì, ó ṣe pàtàkì láti kọ́kọ́ mọ àwọn jínì pàtó tí a fojúsùn ní ipa ọ̀nà náà. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn ìwádìí wa fihàn pé àwọn jínì ní ipa ọ̀nà kan náà kò dáhùn ní ọ̀nà kan náà sí wàhálà kan náà. Ní tòótọ́, àwọn ìwádìí ìṣáájú ti fihàn pé àwọn jínì tó yàtọ̀ síra ní ipa ọ̀nà kan náà lè fi àwọn profaili ìdáhùn àkókò tó yàtọ̀ hàn30,46. Ní àfikún, àwọn ìlànà lẹ́yìn ìkọ̀wé dídíjú wà tí ó ń ba ìbáṣepọ̀ láàrín ìkọ̀wé àti iṣẹ́ jínì jẹ́. Àwọn ìwádìí Proteomic lè fúnni ní òye nípa ipa ti PTM àti iṣẹ́ amuaradagba, ṣùgbọ́n wọ́n tún ń fa àwọn ìpèníjà pẹ̀lú àwọn ọ̀nà ìṣiṣẹ́ kékeré, àwọn ìpíndọ́gba àmì-sí-ariwo gíga, àti ìpinnu tí kò dára.
Nínú ọ̀rọ̀ yìí, kíkẹ́kọ̀ọ́ nípa ìrísí mitochondrial nípa lílo TEM àti MEL ní agbára ńlá láti dáhùn àwọn ìbéèrè pàtàkì nípa ìbáṣepọ̀ láàárín ìrísí mitochondrial àti iṣẹ́ àti bí èyí ṣe ní ipa lórí àrùn. Èyí tó ṣe pàtàkì jùlọ ni pé, TEM pèsè ọ̀nà tààrà fún wíwọ̀n ìrísí mitochondrial gẹ́gẹ́ bí ìpele ìdàpọ̀ ti àìṣiṣẹ́ mitochondrial àti ìṣiṣẹ́51. MEL tún pèsè ọ̀nà tààrà fún wíwo àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ fission àti fusion nínú àyíká sẹ́ẹ̀lì oníwọ̀n mẹ́ta, èyí tó ń jẹ́ kí a lè ṣe ìwọ̀n ìtúnṣe mitochondrial oníyípadà kódà láìsí àwọn ìyípadà nínú ìfìhàn jínì33. Níbí, a tẹnu mọ́ àǹfààní àwọn ọ̀nà àwòrán mitochondrial nínú àwọn àrùn mitochondrial kejì. Àwọn àrùn wọ̀nyí sábà máa ń jẹ́ àmì ìdààmú ìṣiṣẹ́ ara oníwọ̀n onígbà díẹ̀ tí a ṣe àfihàn rẹ̀ nípa àtúnṣe díẹ̀díẹ̀ ti àwọn nẹ́tíwọ́ọ̀kì mitochondrial dípò ìbàjẹ́ mitochondrial ńlá. Síbẹ̀síbẹ̀, ìsanpadà mitochondrial tí a nílò láti pa mitosis mọ́ lábẹ́ ìdààmú onígbà díẹ̀ ní àwọn àbájáde iṣẹ́ gígún. Nínú ọ̀rọ̀ neuroscience, òye tó dára jù nípa àwọn ọ̀nà ìsanpadà wọ̀nyí lè fúnni ní ìwífún pàtàkì nípa pleiotropic neuropathology tí ó ní í ṣe pẹ̀lú àìṣiṣẹ́ mitochondrial.
Níkẹyìn, àwọn ìwádìí wa tẹnu mọ́ àǹfààní àwọn ọ̀nà àwòrán fún òye àwọn àbájáde iṣẹ́-ṣíṣe ti àwọn ìbáṣepọ̀ dídíjú láàárín ìfìhàn jínì, àwọn àtúnṣe amuaradagba, àti iṣẹ́ amuaradagba tí ó ń ṣàkóso ìṣiṣẹ́ mitochondrial neuronal. A lo PPA láti ṣe àwòṣe àìṣiṣẹ́ mitochondrial nínú àwòṣe sẹ́ẹ̀lì neuronal láti ní òye sí apá mitochondrial ti ASD. Àwọn sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y tí a tọ́jú pẹ̀lú PPA fi àwọn àyípadà hàn nínú ìṣiṣẹ́ mitochondrial: mitochondria di kékeré àti yípo, a sì ṣe àpèjúwe cristae tí kò dára nígbà tí TEM ṣe àkíyèsí rẹ̀. Ìwádìí MEL fihàn pé àwọn àyípadà wọ̀nyí máa ń wáyé ní ìbámu pẹ̀lú ìbísí nínú àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ fission àti fusion láti tọ́jú nẹ́tíwọ́ọ̀kì mitochondrial ní ìdáhùn sí ìdààmú ìṣiṣẹ́ díẹ̀. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, PPA ń da ìlànà transcriptional ti mitochondrial metabolism àti homeostasis rú ní pàtàkì. A dá cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, àti OPA1 mọ̀ gẹ́gẹ́ bí àwọn olùṣàkóso mitochondrial pàtàkì tí wahala PPA ń dàrú, wọ́n sì lè kó ipa nínú ṣíṣe àtúnṣe àwọn àyípadà tí PPA ń fà nínú ìṣiṣẹ́ mitochondrial àti iṣẹ́ mitochondrial. Àwọn ìkẹ́kọ̀ọ́ ọjọ́ iwájú ni a nílò láti ṣàfihàn àwọn àyípadà ìgbà tí PPA ń fà nínú ìfìhàn jínì àti iṣẹ́ amuaradagba, ìbílẹ̀, àti àwọn àtúnṣe lẹ́yìn ìtumọ̀. Àwọn ìwádìí wa tẹnu mọ́ ìṣòro àti ìgbẹ́kẹ̀lé àwọn ìlànà ìṣàkóso tí ó ń ṣe àkóso ìdáhùn sí ìṣòro mitochondrial, wọ́n sì fi àǹfààní TEM àti àwọn ọ̀nà àwòrán mìíràn hàn fún àwọn ìwádìí ẹ̀rọ tí a fojúsùn sí.
A ra ìlà sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) láti ọ̀dọ̀ Sigma-Aldrich. A gbin sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y nínú àdàpọ̀ oúnjẹ àárín/F-12 ti Dulbecco (DMEM/F-12) àti L-glutamine (SC09411, ScienCell) nínú àwọn ìgò 25 cm2 tí a fi 20% serum ẹran inú oyún (FBS) kún (10493106, ThermoFisher Scientific) àti 1% penicillin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ní 37 °C, 5% CO2. A fi 0.05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific) ṣe àgbékalẹ̀ sẹ́ẹ̀lì náà sí 80% confluence, a sì fi centrifuge sí i ní ìwọ̀n tó tó 7 × 105 sẹ́ẹ̀lì/ml. Gbogbo àwọn àyẹ̀wò ni a ṣe lórí àwọn sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y tí kò ní ìyàtọ̀ láàárín àwọn ìpín 19–22. A fún ni PPA gẹ́gẹ́ bí NaP. Tú lulú NaP (CAS No. 137-40-6, agbekalẹ kemikali C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) nínú omi MilliQ gbígbóná sí ìwọ̀n 1 M kí o sì tọ́jú rẹ̀ ní 4 °C. Ní ọjọ́ ìtọ́jú náà, fi omi yìí pò pẹ̀lú 1 M PPA sí 3 mM àti 5 mM PPA nínú ohun èlò tí kò ní serum (DMEM/F-12 pẹ̀lú L-glutamine). Ìwọ̀n ìtọ́jú fún gbogbo àwọn àyẹ̀wò kò sí PPA (0 mM, control), 3 mM, àti 5 mM PPA. Àwọn àyẹ̀wò náà ni a ṣe ní ó kéré tán àwọn àtúnṣe ẹ̀dá mẹ́ta.
A gbìn àwọn sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y sínú àwọn ìgò 25 cm5 ní ìwọ̀n 5.5 × 105 sẹ́ẹ̀lì/ml, a sì gbìn wọ́n fún wákàtí 24. A fi ìtọ́jú PPA kún ìgò náà kí ó tó di wákàtí 24 tí a fi gún un. Gba àwọn ìgò sẹ́ẹ̀lì náà ní ìbámu pẹ̀lú ìlànà ìṣẹ̀dá àsopọ ẹranko onígbà-ẹranko (tí a ṣàlàyé lókè). A tún fi ìgò sẹ́ẹ̀lì náà sínú 100 µl 2.5% glutaraldehyde, 1× PBS, kí a sì tọ́jú rẹ̀ ní 4 °C títí tí a ó fi lò ó. A fi ìgò sẹ́ẹ̀lì SH-SY5Y sínú centrifuge fún ìgbà díẹ̀ láti pa àwọn sẹ́ẹ̀lì náà kí a sì yọ 2.5% glutaraldehyde, omi 1× PBS kúrò. A tún fi ìgò náà sínú 4% jeli agarose tí a pèsè sínú omi tí a ti fọ̀ (ìpíndọ́gba agarose sí ìwọ̀n ìgò jẹ́ 1:1). A gbé àwọn ègé Agarose sórí àwọn àwo tí a fi pẹ̀lẹ́pẹ̀lẹ́ bò wọ́n, a sì fi 1-hexadecene bò wọ́n kí wọ́n tó di didi. A fi àwọn àpẹẹrẹ sínú acetone gbígbẹ 100% ní -90°C fún wákàtí 24. Lẹ́yìn náà, a gbé ìwọ̀n otútù náà sókè sí -80°C, a sì fi omi osmium tetroxide 1% àti glutaraldehyde 0.1% kún un. A tọ́jú àwọn àpẹẹrẹ náà sí -80°C fún wákàtí 24. Lẹ́yìn èyí, a mú ìwọ̀n otútù náà pọ̀ sí i díẹ̀díẹ̀ sí ìwọ̀n otútù yàrá fún ọjọ́ mélòó kan: láti - 80°C sí - 50°C fún wákàtí 24, sí - 30°C fún wákàtí 24, sí - 10°C fún wákàtí 24 àti ní ìkẹyìn sí ìwọ̀n otútù yàrá.
Lẹ́yìn ìṣètò cryogenic, a fi resini sí àwọn àyẹ̀wò náà, a sì fi Leica Reichert UltracutS ultramicrotome (Leica Microsystems) ṣe àwọn àyẹ̀wò náà (tó tó 100 nm). A fi 2% uranyl acetate àti lead citrate ṣe àwọ̀ àwọn àyẹ̀wò náà. A ṣe àyẹ̀wò àwọn àyẹ̀wò náà nípa lílo FEI Tecnai 20 transmission electron microscope (ThermoFisher (tí a mọ̀ sí FEI tẹ́lẹ̀), Eindhoven, The Netherlands) tí ń ṣiṣẹ́ ní 200 kV (Lab6 transmitter) àti kámẹ́rà Gatan CCD (Gatan, UK) tí a fi àlẹ̀mọ́ agbára Tridiem ṣe.
Nínú àtúnṣe ìmọ̀ ẹ̀rọ kọ̀ọ̀kan, ó kéré tán àwòrán sẹ́ẹ̀lì kan ṣoṣo 24 ni a gbà, fún àpapọ̀ àwòrán 266. Gbogbo àwòrán ni a ṣe àyẹ̀wò nípa lílo macro Region of Interest (ROI) àti macro Mitochondria. Macro mitochondrial da lórí àwọn ọ̀nà tí a tẹ̀ jáde17,31,32 ó sì gba ìṣiṣẹ́ àkójọpọ̀ aládàáṣe ti àwọn àwòrán TEM ní Fiji/ImageJ69 láàyè. Ní kúkúrú: àwòrán náà ni a yí padà tí a sì yí padà nípa lílo ìyọkúrò ẹ̀yìn ball rolling (radius pixel 60) àti àlẹ̀mọ́ bandpass FFT (ní lílo àwọn ààlà òkè àti ìsàlẹ̀ 60 àti 8 pixel lẹ́sẹẹsẹ) àti ìdènà ìlà inaro pẹ̀lú ìfaradà ìtọ́sọ́nà ti 5%. A ṣe ààlà àwòrán tí a ṣe iṣẹ́ náà láìfọwọ́sí nípa lílo algoridimu entropy tí ó pọ̀ jùlọ àti pé a ṣe àgbékalẹ̀ ìbòjú binary. A yọ àwọn agbègbè àwòrán tí ó ní í ṣe pẹ̀lú àwọn ROI tí a yàn pẹ̀lú ọwọ́ nínú àwọn àwòrán TEM tí a kò ṣe é, tí ó ṣe àfihàn mitochondria àti pé a yọ membrane plasma àti àwọn agbègbè mìíràn tí ó ní ìyàtọ̀ gíga kúrò. Fún ROI kọ̀ọ̀kan tí a yọ jáde, a ṣe àyẹ̀wò àwọn èròjà onípele méjì tí ó tóbi ju 600 píksẹ́lì lọ, a sì wọn agbègbè èròjà, àyíká, àwọn àáké pàtàkì àti àwọn kékeré, ìwọ̀n Feret, yípo, àti yípo nípa lílo àwọn iṣẹ́ ìwọ̀n tí a ṣe sínú Fiji/ImageJ. Lẹ́yìn Merrill, Flippo, àti Strack (2017), agbègbè 2, ìpíndọ́gba ìpíndọ́gba ìpíndọ́gba (ìpíndọ́gba ìpíndọ́gba ìpíndọ́gba kékeré sí kékeré), àti ìpíndọ́gba ìrísí (FF) láti inú àwọn dátà wọ̀nyí, níbi tí FF = agbègbè 2/4pi x. A lè rí ìtumọ̀ fọ́múlá parametric nínú Merrill, Flippo, àti Strack (2017). Àwọn mákírósíkì tí a mẹ́nu kàn wà lórí GitHub (wo Ìgbékalẹ̀ Wíwà Dátà). Ní ​​àròpín, a ṣe àyẹ̀wò tó 5,600 èròjà fún ìtọ́jú PPA, fún àpapọ̀ tó 17,000 èròjà (ìpíndọ́gba kò hàn).
A gbé àwọn sẹ́ẹ̀lì SH-SH5Y sínú àwọn oúnjẹ àṣà ìbílẹ̀ oníyàrá mẹ́jọ (ThermoFisher, #155411) láti jẹ́ kí ó lẹ̀ mọ́ ara wọn ní alẹ́, lẹ́yìn náà a fi TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) àti Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) sínú àwọ̀. A gba àwọn àwòrán nípa lílo 405 nm àti 561 nm léésà lórí àyíká ìṣẹ́jú 10, a sì gba àwọn àwòrán tí a kò rí gẹ́gẹ́ bí àwọn z-stacks tí ó ní àwọn mákrófáfù àwòrán 10 pẹ̀lú ìgbésẹ̀ az ti 0.2 μm láàrín àwọn fírẹ́mù àwòrán ní àwọn àkókò àkókò 12 tí ó tẹ̀lé e. A gba àwọn àwòrán nípa lílo platform Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 super-resolution (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) nípa lílo lẹ́ńsì LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. A ṣe àgbéyẹ̀wò àwọn àwòrán nínú ImageJ nípa lílo ọ̀nà pípẹ́ tí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀ àti àfikún ImageJ láti wọn àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ ìdàpọ̀ àti ìfọ́sí, iye àpapọ̀ àwọn ètò mitochondrial, àti ìwọ̀n mitochondrial àpapọ̀ fún sẹ́ẹ̀lì33. Àwọn macros MEL wà lórí GitHub (wo Gbólóhùn Wíwà Dátà).
A gbin awọn sẹẹli SH-SY5Y sinu awọn awo mẹfa pẹlu iwuwo ti awọn sẹẹli 0.3 × 106 / mL fun wakati 24 ṣaaju itọju. A fa RNA jade nipa lilo ilana Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) pẹlu awọn iyipada diẹ: fi 300 μl ti RNA lysis buffer kun si kanga kọọkan ṣaaju yiyọ kuro ki o si tan ayẹwo kọọkan gẹgẹbi igbesẹ ikẹhin pẹlu 30 μl ti omi ti ko ni DNase/RNase. Gbogbo awọn ayẹwo ni a ṣayẹwo fun iye ati didara nipa lilo NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer. A gba gbogbo amuaradagba lati inu awọn sẹẹli lysates nipa lilo 200 μl RIPA lysis buffer, a si ṣe iwọn ifọkansi amuaradagba nipa lilo idanwo amuaradagba Bradford70.
A ṣe ìṣẹ̀dá cDNA nípa lílo Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè pẹ̀lú àwọn àtúnṣe díẹ̀. A ṣe ìṣẹ̀dá cDNA nínú àwọn ìṣesí 20-μl nípa lílo 0.7 sí 1 μg ti àpapọ̀ RNA. A yan àwọn alákọ́bẹ̀rẹ̀ láti inú àwọn ìwé tí a tẹ̀ jáde tẹ́lẹ̀ 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Table S1) àti àwọn ìwádìí tí ó tẹ̀lé e ni a ṣe nípa lílo ohun èlò PrimerQuest láti Integrated DNA Technologies. Gbogbo àwọn jínì tí ó ní ìfẹ́ sí ni a ṣe déédé sí jínì nuclear B2M. A wọn ìfihàn jínì ti STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC àti OPA1 nípa lílo RT-qPCR. Àdàpọ̀ olú-ìdápọ̀ náà ní LUNA Taq polymerase (M3003L, New England Biolabs), àwọn primers síwájú àti reverse 10 μM, cDNA, àti omi PCR-grade láti mú ìwọ̀n ìkẹyìn 10 μL jáde fún ìṣe kọ̀ọ̀kan. A wọn ìfarahàn àwọn jiini ìpínyà àti fission (DRP1, MFN1/2) nípa lílo àwọn àyẹ̀wò multiplex TaqMan. A lo Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè pẹ̀lú àwọn àtúnṣe díẹ̀. Multiplex RT-qPCR master mix náà ní 1X LUNA Taq polymerase, 10 μM forward àti reverse primers, 10 μM probe, cDNA, àti omi PCR-grade, èyí tí ó yọrí sí ìwọ̀n ìkẹyìn 20 μL fún ìṣe kọ̀ọ̀kan. A ṣe RT-qPCR nípa lílo Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—nọ́mbà serial: R0618110). Àwọn ipò kẹ̀kẹ́ ni a fihàn nínú Táblì S1. Gbogbo àwọn àpẹẹrẹ cDNA ni a mú pọ̀ sí i ní ìlọ́po mẹ́ta, a sì ṣe ìlọ́po mẹ́wàá ìlọ́po ìlọ́po méjì ìṣànpọ̀. A yọ àwọn àbájáde nínú àwọn àpẹẹrẹ mẹ́ta pẹ̀lú ìyàtọ̀ ààbọ̀ ìpele cycle (Ct) >0.5 kúrò nínú ìwádìí náà láti rí i dájú pé a lè ṣe àtúnṣe dátà30,72. A ṣírò ìfihàn jínì ìbátan nípa lílo ọ̀nà 2-ΔΔCt79.
A da àwọn àpẹẹrẹ amuaradagba (60 μg) pọ̀ mọ́ Laemmli loading buffer ní ìpíndọ́gba 2:1, a sì ṣiṣẹ́ lórí jeli amuaradagba aláìláwọ̀ 12% (Bio-Rad #1610184). A gbé àwọn protein lọ sí membrane PVDF (polyvinylidene fluoride) (#170-84156, Bio-Rad) nípa lílo sistemu Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). A dí membrane náà, a sì fi àwọn antibodies àkọ́kọ́ tó yẹ (OPA1, MFN1, MFN2, àti DRP1) (tí a ti pò mọ́ 1:1000) sínú rẹ̀ fún wákàtí 48, lẹ́yìn náà a fi incubation pẹ̀lú secondary antibodies (1:10,000) sínú rẹ̀ fún wákàtí 1. Lẹ́yìn náà, a ya àwòrán àwọn membranes nípa lílo Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) a sì gba wọ́n sílẹ̀ nípa lílo sistemu Bio-Rad ChemiDoc MP. A lo version ImageLab 6.1 fún ìwádìí Western blot. A fi jeli àti blot àtilẹ̀wá hàn nínú Àwòrán S1. A pèsè ìwífún nípa antibody nínú Táblì S2.
A gbé àwọn ìṣètò dátà kalẹ̀ gẹ́gẹ́ bí àṣìṣe àròpín àti ìpele ti àròpín (SEM) ti ó kéré tán àwọn àpẹẹrẹ mẹ́ta aláìdádúró. A dán àwọn ìṣètò dátà wò fún ìṣètò déédé nípa lílo ìdánwò Shapiro-Wilks (àfi bí a bá sọ ọ́ lọ́nà mìíràn) kí a tó gbé ìpínkiri Gaussian àti àwọn ìyàtọ̀ déédé tí ó sì tẹ̀síwájú pẹ̀lú àwọn ìṣàyẹ̀wò. Ní àfikún sí ṣíṣàyẹ̀wò ìṣètò dátà nípa lílo Fisher's MEL LSD (p < 0.05), ANOVA ọ̀nà kan (ìtọ́jú vs. ìdarí àròpín), àti ìdánwò ìfiwéra púpọ̀ Dunnett láti pinnu ìjẹ́pàtàkì (p < 0.05). Àwọn ìwọ̀n p pàtàkì ni a fihàn nínú àwòrán náà gẹ́gẹ́ bí *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Gbogbo àwọn ìṣàyẹ̀wò àti àwọn àwòrán ìṣirò ni a ṣe tí a sì ṣẹ̀dá nípa lílo GraphPad Prism 9.4.0.
Àwọn mákíró Fiji/ImageJ fún ìṣàyẹ̀wò àwòrán TEM wà ní gbogbogbòò lórí GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Mákíró Mitochondrial Event Locator (MEL) wà ní gbogbogbòò lórí GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM àti Vijaya A. Mitochondria: àwọn olùṣàkóso ìṣiṣẹ́ ara, homeostasis, stress, aging àti epigenetics. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Àìlera mitochondrial onípele púpọ̀ nínú schizophrenia, complex I gẹ́gẹ́ bí ibi tí ó ṣeé ṣe kí ó jẹ́ ibi tí àrùn ti ń tàn kálẹ̀. Schizophrenia. resource. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. àti Beal, Àìlera Mitochondrial MF nínú àrùn Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG àti Mehta V. Mitochondria tí ó ní ìdààmú: àwọn ibi tí a ti ń gbógun ti àrùn Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF àti Ferreira GK Mitochondria àti ọpọlọ: àwọn ohun èlò ìṣiṣẹ́ ara àti àwọn mìíràn. Àwọn ohun èlò ìṣiṣẹ́ ara. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. àti àwọn ẹlòmíràn. Mitochondria Pleiotropic: ipa ti mitochondria lori idagbasoke neuronal ati arun. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. àti Morais, VA. Ìṣẹ̀dá ara-ẹni nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì ara: báwo àti ibi tí. ìbáṣepọ̀ àgbáyé. J. Mohr. ìmọ̀ sáyẹ́ǹsì. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. àti Zhao, J. Ìlànà ti ìṣiṣẹ́ mitochondrial ẹranko: àwọn àǹfààní àti ìpèníjà. iwájú. endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. àti Slack, RS Ìṣiṣẹ́ Mitochondrial nínú ìṣàkóso neurogenesis: láti inú ọpọlọ tó ń dàgbà sí ọpọlọ àgbàlagbà. ìdàgbàsókè. ìṣiṣẹ́. 247, 47–53 (2018).