Àdírẹ́sì lọ́wọ́lọ́wọ́: Cologne 50931, Germany, Cologne Excellence Cluster Research lórí Ìdáhùn Stress Cellular nínú Àwọn Àrùn Tó Jọpọ̀ Ọjọ́ Ogbó (CECAD).
A kà á sí pé ìyípadà ọpọlọ àwọn àrùn mitochondrial kò ṣeé yípadà nítorí pé agbára ìṣiṣẹ́ ara àwọn neurons kò tó, ṣùgbọ́n ipa àìṣiṣẹ́ ara mitochondrial lórí agbára ìṣiṣẹ́ ara sẹ́ẹ̀lì ti ìṣiṣẹ́ ara sẹ́ẹ̀lì nínú ara kò yé wa dáadáa. Níbí, a ṣe àgbékalẹ̀ proteome pàtó sẹ́ẹ̀lì ti àwọn neurons Purkinje pẹ̀lú àìtó OXPHOS tí ó ń tẹ̀síwájú tí ó jẹ́yọ láti inú ìṣiṣẹ́ ara mitochondrial tí ó dí. A rí i pé àìṣiṣẹ́ ara mitochondrial fa ìyípadà ńlá kan nínú pápá proteomics, èyí tí ó yọrí sí ìṣiṣẹ́ ìṣiṣẹ́ ara tí ó péye ṣáájú ikú sẹ́ẹ̀lì. Láìròtẹ́lẹ̀, a pinnu ìfàsẹ́yìn tí ó hàn gbangba ti pyruvate carboxylase (PCx) àti àwọn enzymes mìíràn tí ó lòdì sí ọjọ́-ogbó tí ó ń ṣe àfikún àwọn àárín ti ìṣiṣẹ́ TCA. Ìdènà PCx mú kí wahala oxidative àti neurodegeneration pọ̀ sí i, èyí tí ó fihàn pé atherosclerosis ní ipa ààbò nínú àwọn neurons tí kò ní OXPHOS. Ìtúnṣe mitochondrial fusion nínú àwọn neurons tí ó ti bàjẹ́ pátápátá yí àwọn ànímọ́ ìṣiṣẹ́ ara wọ̀nyí padà pátápátá, nípa bẹ́ẹ̀ ó ń dènà ikú sẹ́ẹ̀lì. Àwọn àwárí wa ṣàfihàn àwọn ipa ọ̀nà tí a kò mọ̀ tẹ́lẹ̀ tí ó fúnni ní agbára ìṣiṣẹ́ ara mitochondrial àti fihàn pé neurodegeneration le yí padà kódà ní àwọn ìpele ìkẹyìn ti àrùn náà.
Ipa pàtàkì ti mitochondria ninu mimu iṣelọpọ agbara neuronal ni a tẹnumọ nipasẹ awọn aami aisan ti o gbooro ti o ni nkan ṣe pẹlu awọn arun mitochondrial eniyan. Pupọ julọ awọn aisan wọnyi ni o fa nipasẹ awọn iyipada jiini ti o nṣakoso ikosile jiini mitochondrial (1, 2) tabi iparun jiini ti o ni ibatan si awọn agbara mitochondrial, eyiti o ni ipa taara lori iduroṣinṣin ti DNA mitochondrial (mtDNA) (3, 4). Iṣẹ ninu awọn awoṣe ẹranko ti fihan pe ni idahun si iṣẹ-ṣiṣe mitochondrial ninu awọn sẹẹli ti o wa ni ayika, awọn ipa ọna iṣelọpọ conservative (5-7) le mu ṣiṣẹ, eyiti o pese alaye pataki fun oye jinle ti pathogenesis ti awọn arun ti o nira wọnyi. Ni idakeji ti o han gbangba, oye wa nipa awọn iyipada iṣelọpọ ti awọn iru sẹẹli kan pato ti ikuna gbogbogbo ti iṣelọpọ mitochondrial adenosine triphosphate (ATP) ọpọlọ fa jẹ ipilẹ (8), ti o tẹnumọ iwulo lati ṣe idanimọ awọn ibi-afẹde itọju ti a le lo lati ṣe idiwọ tabi ṣe idiwọ arun. Dena neurodegeneration (9). Aini alaye ni otitọ pe awọn sẹẹli nafu ni a gba ni gbogbogbo lati ni irọrun iṣelọpọ ti o ni opin pupọ ni akawe si awọn iru sẹẹli ti awọn ara ti o wa ni ayika (10). Nítorí pé àwọn sẹ́ẹ̀lì wọ̀nyí ń kó ipa pàtàkì nínú ṣíṣètò ìpèsè àwọn metabolites sí àwọn neurons láti gbé ìgbésẹ̀ synaptic lárugẹ àti láti dáhùn sí àwọn ìpalára àti àìsàn, agbára láti mú ìṣiṣẹ́ sẹ́ẹ̀lì bá àwọn ipò ìpèníjà ti àsopọ ọpọlọ jẹ́ díẹ̀ sí àwọn sẹ́ẹ̀lì glial (11-14). Ní ​​àfikún, ìyàtọ̀ sẹ́ẹ̀lì tí ó wà nínú àsopọ ọpọlọ ń dí ìwádìí àwọn àyípadà ìṣiṣẹ́ ara tí ó ń ṣẹlẹ̀ nínú àwọn ẹgbẹ́ neuronal pàtó kan lọ́wọ́. Nítorí náà, a kò mọ púpọ̀ nípa àwọn àbájáde cellular àti metabolic ti àìṣiṣẹ́ mitochondrial nínú àwọn neurons.
Láti lè lóye àwọn àbájáde ìṣiṣẹ́ ara tí àìṣiṣẹ́ mitochondrial ṣe, a ya àwọn neurons Purkinje (PNs) sọ́tọ̀ ní oríṣiríṣi ìpele ti neurodegeneration tí ìparun mitochondrial ode membrane fusion (Mfn2) fà. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn ìyípadà Mfn2 nínú ènìyàn ní í ṣe pẹ̀lú irú neuropathy motor sensory neuropathy tí a mọ̀ sí Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), ìparun ipò ti Mfn2 nínú àwọn eku jẹ́ ọ̀nà àìṣiṣẹ́ oxidation Phosphorylation (OXPHOS) tí a mọ̀ dáadáa. Àwọn oríṣiríṣi neuronal subtypes (16-19) àti ìrísí neurodegenerative tí ó yọrí sí ni a tẹ̀lé pẹ̀lú àwọn àmì àrùn neurological onítẹ̀síwájú, bíi àwọn ìṣòro ìṣípo (18, 19) tàbí cerebellar ataxia (16). Nípa lílo àpapọ̀ àwọn proteomics, metabolomics, imaging, àti virological methods, a fihàn pé neurodegeneration onítẹ̀síwájú ń fa pyruvate carboxylase (PCx) àti àwọn ohun mìíràn tí ó ní í ṣe pẹ̀lú arteriosclerosis ti PNs ní vivo Ìfihàn àwọn enzymes. Láti fìdí ìjẹ́pàtàkì àwárí yìí múlẹ̀, a ṣe àtúnṣe pàtàkì sí ìfarahàn PCx nínú àwọn PN tí kò ní Mfn2, a sì rí i pé iṣẹ́ abẹ yìí mú kí wahala oxidative pọ̀ sí i, ó sì mú kí neurodegeneration yára sí i, èyí sì fi hàn pé azoospermia fún ikú sẹ́ẹ̀lì ní agbára ìṣàtúnṣe ìṣẹ̀dá. Ìfarahàn líle ti MFN2 lè gba PN ìbàjẹ́ pátápátá pẹ̀lú àìtó OXPHOS líle, lílo DNA mitochondrial púpọ̀, àti nẹ́ẹ̀tìwọ́ọ̀kì mitochondrial tí ó bàjẹ́, èyí tí ó tún tẹnumọ́ pé irú neurodegeneration yìí lè tún padà bọ̀ sípò ní ìpele àìsàn kí ó tó kú sẹ́ẹ̀lì.
Láti lè fojú inú wo mitochondria nínú àwọn PN knockout Mfn2, a lo oríṣi eku kan tí ó fún mitochondria tí ó dúró lórí Cre-dependent láyè láti fojú sí amuaradagba fluorescent ofeefee (YFP) (mtYFP) (20) Ìfarahàn Cre àti ṣàyẹ̀wò ìrísí mitochondrial ní vivo. A rí i pé ìparun jínì Mfn2 nínú PNs yóò yọrí sí pípín díẹ̀díẹ̀ ti nẹ́tíwọ́ọ̀kì mitochondrial (Àwòrán S1A), a sì rí ìyípadà àkọ́kọ́ ní ọ̀sẹ̀ mẹ́ta tí ọmọ náà bá pé. Ní ìyàtọ̀ sí èyí, ìbàjẹ́ ńlá ti ìpele sẹ́ẹ̀lì PN, gẹ́gẹ́ bí a ti rí i nípasẹ̀ pípadánù Calbindin immunostaining, kò bẹ̀rẹ̀ títí di ọ̀sẹ̀ 12 tí ọmọ náà bá pé (Àwòrán 1, A àti B). Àìbáramu àkókò láàárín àwọn ìyípadà àkọ́kọ́ nínú ìrísí mitochondrial àti ìbísí ikú neuronal tí ó hàn gbangba mú kí a ṣe ìwádìí àwọn ìyípadà ìṣiṣẹ́ ara tí àìṣiṣẹ́ mitochondrial ń fà kí sẹ́ẹ̀lì tó kú. A ṣe agbekalẹ ọgbọn ti o da lori sisọ sẹẹli ti a mu ṣiṣẹ ni fluorescence (FACS) lati ya sọtọ PN ti n ṣalaye YFP (YFP+) (Aworan 1C), ati ninu awọn eku iṣakoso (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP: : L7-cre), ti a tọka si nihin bi CTRL (Aworan S1B). Imudarasi ti ọgbọn gating ti o da lori agbara ibatan ti ifihan agbara YFP gba wa laaye lati sọ ara YFP+ (YFPhigh) ti PNs kuro ninu awọn ti kii ṣe PNs (YFPneg) (Aworan S1B) tabi awọn ege axon/dendritic fluorescent ti o wa ni putative (YFPlow; Aworan S1D, apa osi), ti a jẹrisi nipasẹ maikirosikopu confocal (Aworan S1D, apa ọtun). Lati le jẹrisi idanimọ awọn olugbe ti a pin si, a ṣe awọn proteomics LFQ ati lẹhinna itupalẹ awọn paati akọkọ, a si rii pe iyatọ ti o han gbangba wa laarin awọn sẹẹli YFPhigh ati YFPneg (Aworan S1C). Àwọn sẹ́ẹ̀lì gíga YFP fi ìdàgbàsókè àpapọ̀ àwọn àmì PN tí a mọ̀ hàn (bíi Calb1, Pcp2, Grid2 àti Itpr3) (21, 22), ṣùgbọ́n kò sí ìdàgbàsókè àwọn prótéènì tí a sábà máa ń sọ nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì gíga tàbí àwọn irú sẹ́ẹ̀lì mìíràn (Àwòrán 1D)). Ìfiwéra láàárín àwọn àpẹẹrẹ nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì gíga YFP tí a kó jọ nínú àwọn àyẹ̀wò aláìdámọ̀ fi ìṣọ̀kan ìbáramu > 0.9 hàn, èyí tí ó fi ìtúnṣe rere hàn láàrín àwọn àtúnṣe ẹ̀dá (Àwòrán S1E). Ní ​​àkótán, àwọn dátà wọ̀nyí fi ètò wa hàn fún ìyàsọ́tọ̀ PN tí ó ṣeé ṣe kí ó jẹ́ kí ó le koko àti pàtó. Nítorí pé ètò awakọ̀ L7-cre tí a lò ń fa ìdàpọ̀ mosaic ní ọ̀sẹ̀ àkọ́kọ́ lẹ́yìn ìbísí (23), a bẹ̀rẹ̀ sí í pa àwọn eku kúrò láti inú CTRL àti conditional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Gba àwọn sẹ́ẹ̀lì. Lẹ́yìn tí a bá ti parí ìdàpọ̀, a ń pè é ní Mfn2cKO ní ọ̀sẹ̀ mẹ́rin. Gẹ́gẹ́ bí òpin, a yan ọ̀sẹ̀ mẹ́jọ tí a fi pé PN ti pé láìka ìpínyà mitochondrial tí ó hàn gbangba sí (Àwòrán 1B àti Àwòrán S1A). Ní ​​gbogbogbòò, a ṣe ìṣírò àpapọ̀ àwọn amuaradagba 3013, nínú èyí tí nǹkan bí 22% jẹ́ ti MitoCarta 2.0 tí ó dá lórí protein mitochondrial gẹ́gẹ́ bí mitochondria (Àwòrán 1E) (Àwòrán 1E) (24). Ìṣàyẹ̀wò ìṣàfihàn ìran tí a ṣe ní ọ̀sẹ̀ 8 fihàn pé 10.5% nínú gbogbo àwọn amuaradagba nìkan ni ó ní àwọn àyípadà pàtàkì (Àwòrán 1F àti Àwòrán S1F), nínú èyí tí a dín àwọn amuaradagba 195 kù àti àwọn protein 120 ni a gbé ga (Àwòrán 1F). Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé “àyẹ̀wò ipa ọ̀nà tuntun” ti àkójọ dátà yìí fihàn pé àwọn jiini tí a fi ìyàtọ̀ hàn jẹ́ ti àkójọ àwọn ipa ọ̀nà kan pàtó tí a dínkù (Àwòrán 1G). Ó yani lẹ́nu pé, bó tilẹ̀ jẹ́ pé ìdínkù àwọn ipa ọ̀nà tó níí ṣe pẹ̀lú OXPHOS àti ìfàmọ́ra calcium jẹ́rìí sí ìfàsẹ́yìn àìṣiṣẹ́ mitochondrial nínú àwọn PN tí kò ní ìdàpọ̀, àwọn ẹ̀ka mìíràn tí ó níí ṣe pẹ̀lú ìṣiṣẹ́ amino acid ni a gbéga ní pàtàkì, èyí tí ó bá ìṣiṣẹ́ tí ó ń ṣẹlẹ̀ nínú mitochondrial PNs mu. Àtúnṣe ìṣiṣẹ́ náà dúró ṣinṣin.
(A) Àwọn fọ́tò confocal aṣojú ti àwọn ẹ̀yà cerebellar ti àwọn eku CTRL àti Mfn2cKO tí ó ń fi ìpàdánù PNs tí ń tẹ̀síwájú hàn (calbindin, grẹy); àwọn nucleus ni a fi DAPI dìbò. (B) Ìwọ̀n (A) (ìṣàyẹ̀wò ìyàtọ̀ ọ̀nà kan, ***P<0.001; n = 4 sí 6 iyika láti inú àwọn eku mẹ́ta). (C) Ìṣiṣẹ́ ìwádìí. (D) Pínpín àwòrán ooru ti àwọn àmì pàtó sí Purkinje (òkè) àti àwọn irú sẹ́ẹ̀lì mìíràn (àárín). (E) Àwòrán Venn tí ó ń fi iye àwọn amuaradagba mitochondrial tí a dá mọ̀ nínú PN tí a yà sọ́tọ̀. (F) Àwòrán volcano ti àwọn amuaradagba tí a yà sọ́tọ̀ ní àwọn neuron Mfn2cKO ní ọ̀sẹ̀ 8 (iye pípa-pipa pàtàkì ti 1.3). (G) Ìṣàyẹ̀wò ipa ọ̀nà ẹ̀dá fihàn àwọn ipa ọ̀nà gíga márùn-ún tí ó ṣe pàtàkì jùlọ (pupa) àti ìsàlẹ̀-ìlànà (blue) nínú Mfn2cKO PN tí a pín sí ọ̀sẹ̀ 8. A fihàn ìpele ìfihàn àpapọ̀ ti amuaradagba kọ̀ọ̀kan tí a rí. Àwòrán ooru greyscale: iye P tí a ṣàtúnṣe. ns, kìí ṣe pàtàkì.
Àwọn ìwádìí Proteomics fi hàn pé ìfarahàn amuaradagba àwọn complexes I, III, àti IV dínkù díẹ̀díẹ̀. Gbogbo Complexes I, III, àti IV ní àwọn subunits pàtàkì tí a fi mtDNA pamọ́, nígbàtí complex II, tí a fi nuclear-code nìkan kọ́, kò ní ipa kankan lórí rẹ̀ (Àwòrán 2A àti Àwòrán S2A). . Ní ìbámu pẹ̀lú àwọn àbájáde proteomics, immunohistochemistry ti àwọn apakan cerebellar àsopọ fihàn pé ìpele subunit MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) ti complex IV nínú PN dínkù díẹ̀díẹ̀ (Àwòrán 2B). Subunit mtDNA tí a fi koodu Mtatp8 kọ́ dínkù gidigidi (Àwòrán S2A), nígbàtí ìpele ìdúróṣinṣin ti subunit ATP synthase tí a fi nuclear-code kọ́ kò yí padà, èyí tí ó bá complex ATP synthase subassem F1 tí a mọ̀ mu nígbàtí ìfarahàn mtDNA bá dúró ṣinṣin. Ìṣẹ̀dá náà dúró ṣinṣin. Dá dúró (7). Ìṣàyẹ̀wò ìpele mtDNA nínú àwọn PN Mfn2cKO tí a ṣètò nípa lílo ìgbésẹ̀ polymerase chain reaction (qPCR) jẹ́rìí sí ìdínkù díẹ̀díẹ̀ nínú nọ́mbà àdàkọ mtDNA. Ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso, ní ọ̀sẹ̀ mẹ́jọ tí wọ́n bí ọmọ, nǹkan bí 20% nínú ìpele mtDNA nìkan ni a pa mọ́ (Àwòrán 2C). Gẹ́gẹ́ bí àwọn àbájáde wọ̀nyí, a lo àwọ̀ confocal microscopy ti Mfn2cKO PNs láti ṣàwárí DNA, èyí tí ó fi hàn pé lílo àwọn nucleotides mitochondrial tí ó sinmi lórí àkókò hàn (Àwòrán 2D). A rí i pé àwọn olùdíje kan ṣoṣo tí ó ní ipa nínú ìbàjẹ́ amuaradagba mitochondrial àti ìdáhùn wahala ni a gbé ga, títí kan Lonp1, Afg3l2 àti Clpx, àti àwọn ohun tí ó ní í ṣe pẹ̀lú ìṣọ̀kan OXPHOS. A kò rí àwọn ìyípadà pàtàkì nínú ìpele àwọn amuaradagba tí ó ní í ṣe pẹ̀lú apoptosis (Àwòrán S2B). Bákan náà, a rí i pé àwọn ikanni mitochondria àti endoplasmic reticulum tí ó ní í ṣe pẹ̀lú gbigbe calcium ní àwọn ìyípadà díẹ̀ péré (Àwòrán S2C). Ní àfikún, ìṣàyẹ̀wò àwọn prótéènì tí ó ní í ṣe pẹ̀lú autophagy kò rí àwọn ìyípadà pàtàkì kankan, èyí tí ó bá ìfàsẹ́yìn autophagosomes tí a rí nínú vivo tí a rí nípasẹ̀ immunohistochemistry àti electron microscopy (Àwòrán S3). Síbẹ̀síbẹ̀, àìṣiṣẹ́ OXPHOS tí ó ń tẹ̀síwájú nínú PNs wà pẹ̀lú àwọn ìyípadà mitochondrial tí ó hàn gbangba. A lè rí àwọn àkójọpọ̀ mitochondrial nínú àwọn ara sẹ́ẹ̀lì àti àwọn igi dendritic ti Mfn2cKO PNs tí wọ́n wà ní ọ̀sẹ̀ márùn-ún àti mẹ́jọ, àti pé ìṣètò awọ inú ti ṣe àwọn ìyípadà jíjinlẹ̀ (Àwòrán S4, A àti B). Ní ​​ìbámu pẹ̀lú àwọn ìyípadà ultrastructural wọ̀nyí àti ìdínkù pàtàkì nínú mtDNA, ìṣàyẹ̀wò àwọn ege cerebellar cerebellar acute pẹ̀lú tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) fihàn pé agbára membrane mitochondrial nínú Mfn2cKO PNs ti dínkù gidigidi (Àwòrán S4C).
(A) Ìṣàyẹ̀wò àkókò ìpele ìfihàn ti àkópọ̀ OXPHOS. Gbé àwọn èròjà P<0.05 yẹ̀wò nìkan ní ọ̀sẹ̀ 8 (ANOVA ọ̀nà méjì). Ìlà oníwọ̀n: Kò sí àtúnṣe ní ìfiwéra pẹ̀lú CTRL. (B) Òsì: Àpẹẹrẹ apá cerebellar tí a fi antibody anti-MTCO1 sí àmì (scale bar, 20 μm). Agbègbè tí àwọn ara sẹ́ẹ̀lì Purkinje gbé sí ni a fi ofeefee bò. Ọ̀tún: Ìṣàyẹ̀wò àwọn ìpele MTCO1 (scale bar ti variance; n = 7 sí 20 cells tí a ṣàyẹ̀wò láti inú àwọn eku mẹ́ta). (C) ìṣàyẹ̀wò qPCR ti nọ́mbà ìdákọ mtDNA nínú PN tí a ṣètò (scale bar ti variance; n = 3 sí 7 eku). (D) Òsì: Àpẹẹrẹ ti cerebellar gé tí a fi antibody anti-DNA sí àmì (scale bar, 20 μm). Agbègbè tí àwọn ara sẹ́ẹ̀lì Purkinje gbé sí ni ofeefee bò. Ọ̀tún: Ìṣàyẹ̀wò àwọn egbo mtDNA (scale bar ti variance; n = 5 sí 9 cells láti inú àwọn eku mẹ́ta). (E) Àpẹẹrẹ apá cerebellar tó ń fi àwọn sẹ́ẹ̀lì mitoYFP + Purkinje hàn (ọfà) nínú gbígba ìdènà ìdènà sẹ́ẹ̀lì gbogbo. (F) Ìwọ̀n ìtẹ̀sí IV. (G) Àwọn ìgbàsílẹ̀ aṣojú ti abẹ́rẹ́ ìṣànwọ́ ìṣànwọ́ nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì CTRL àti Mfn2cKO Purkinje. Ìtọ́sọ́nà òkè: Ìlù àkọ́kọ́ tó fa AP. Ìtọ́sọ́nà ìsàlẹ̀: Ìwọ̀n ìgbà AP tó pọ̀jù. (H) Ìwọ̀n ìgbà tí postsynaptic bá ṣe àyẹ̀wò (sPSP). Ìtọ́sọ́nà ìgbàsílẹ̀ aṣojú àti ìpíndọ́gba ìsúnmọ́ rẹ̀ ni a fihàn nínú (I). Ìwádìí ọ̀nà kan ti ìyàtọ̀ tí a ṣàyẹ̀wò n = 5 sí 20 sẹ́ẹ̀lì láti inú àwọn eku mẹ́ta. A fihàn dátà gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n ±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Àwọn àmì aṣojú ti AP onígbà tí a gbà sílẹ̀ nípa lílo ipò ìdènà ìdènà tí a ti fọ́. Ìtọ́sọ́nà òkè: Ìwọ̀n ìgbà AP tó pọ̀jù. Ìtọ́sọ́nà ìsàlẹ̀: Súnmọ́ AP kan ṣoṣo. (K) Ṣíṣe ìwọ̀n ìgbà AP tó pọ̀jù àti èyí tó pọ̀jù gẹ́gẹ́ bí (J). Ìdánwò Mann-Whitney; a ṣe àyẹ̀wò n = 5 sẹ́ẹ̀lì láti inú àwọn eku mẹ́rin. A ṣe àfihàn dátà gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n ± SEM; kò ṣe pàtàkì.
A rí ìbàjẹ́ OXPHOS tó hàn gbangba nínú Mfn2cKO PN ọ̀sẹ̀ mẹ́jọ, èyí tó fi hàn pé iṣẹ́ ara àwọn neuron kò dára rárá. Nítorí náà, a ṣe àgbéyẹ̀wò àwọn ànímọ́ iná mànàmáná aláìṣiṣẹ́ ti àwọn neuron aláìlera OXPHOS ní ọ̀sẹ̀ mẹ́rin sí márùn-ún àti ọ̀sẹ̀ méje sí mẹ́jọ nípa ṣíṣe àwọn àkọsílẹ̀ ìdènà gbogbo sẹ́ẹ̀lì nínú àwọn ègé cerebellar acute (Àwòrán 2E). Láìròtẹ́lẹ̀, agbára ìsinmi àwọ̀ ara àti ìdènà ìtẹ̀síwájú ti àwọn neuron Mfn2cKO jọra sí ìṣàkóso, bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn ìyàtọ̀ díẹ̀ wà láàrín àwọn sẹ́ẹ̀lì (Àtẹ 1). Bákan náà, ní ọ̀sẹ̀ mẹ́rin sí márùn-ún ti ọjọ́ orí, a kò rí àwọn ìyípadà pàtàkì nínú ìbáṣepọ̀ current-folti (IV curve) (Àwòrán 2F). Síbẹ̀síbẹ̀, kò sí àwọn neuron Mfn2cKO ọ̀sẹ̀ méje sí mẹ́jọ tó yege regimen IV (ìgbésẹ̀ hyperpolarization), èyí tó fi hàn pé ó hàn gbangba pé agbára hyperpolarization wà ní ìpele ìkẹyìn yìí. Ní ìyàtọ̀ sí èyí, nínú àwọn neuron Mfn2cKO, àwọn current depolarizing tí ó ń fa ìtújáde agbára ìṣe tí ó ń tún ara ṣe (AP) ni a fara mọ́ dáadáa, èyí tí ó fihàn pé àwọn ìlànà ìtújáde gbogbo wọn kò yàtọ̀ sí ti àwọn neuron iṣakoso ọ̀sẹ̀ 8 (Tábẹ́lì 1 àti Àwòrán 2G). Bákan náà, ìpele àti ìtóbi ti sponset postsynaptic currents (sPSCs) jọ ti àwọn ti ẹgbẹ́ ìṣàkóso, àti ìpele ìṣẹ̀lẹ̀ pọ̀ sí i láti ọ̀sẹ̀ 4 sí ọ̀sẹ̀ 5 sí ọ̀sẹ̀ 7 sí ọ̀sẹ̀ 8 pẹ̀lú ìbísí kan náà (Àwòrán 2, H àti I). Àkókò ìdàgbàsókè synaptic nínú PNs (25). Àwọn àbájáde kan náà ni a rí lẹ́yìn àwọn pọ́ọ̀tì PNs tí ó ní ihò. Ìṣètò yìí ń dènà ìsanpadà tí ó ṣeé ṣe fún àwọn àbùkù ATP cellular, gẹ́gẹ́ bí ó ti lè ṣẹlẹ̀ nínú gbígba ìdènà patch cell gbogbo. Ní pàtàkì, agbára ìsinmi membrane àti ìgbóná àìròtẹ́lẹ̀ ti àwọn neuron Mfn2cKO kò ní ipa lórí (Àwòrán 2, J àti K). Ní àkótán, àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé àwọn PN tí wọ́n ní àìlera OXPHOS tí ó hàn gbangba lè kojú àwọn àpẹẹrẹ ìtújáde ìgbàlódé gíga dáadáa, èyí tí ó fihàn pé ìlànà ìsanpadà kan wà tí ó fún wọn láyè láti máa ṣe àwọn ìdáhùn electrophysiological tí ó fẹ́rẹ̀ẹ́ déédé.
A ṣe àfihàn àwọn dátà gẹ́gẹ́ bí ìdajì ± SEM (ìṣàyẹ̀wò ìyàtọ̀ ọ̀nà kan, ìdánwò ìfiwéra ọ̀pọ̀lọ́pọ̀ ti Holm-Sidak; *P<0.05). Nọ́mbà ẹyọ náà ni a fi àwọn àmì ìdámọ̀ hàn.
A bẹ̀rẹ̀ sí í ṣe ìwádìí bóyá ẹ̀ka èyíkéyìí nínú ìwádìí proteomics (Àwòrán 1G) ní àwọn ipa ọ̀nà tí ó lè kojú àìtó OXPHOS líle, nípa bẹ́ẹ̀ ó ṣàlàyé ìdí tí PN tí ó ní ipa náà fi lè máa ṣe ìtọ́jú electrophysiology tí ó fẹ́rẹ̀ẹ́ déédé (Àwòrán 2, E sí K). Ìwádìí Proteomics fihàn pé àwọn enzymes tí ó ní ipa nínú catabolism ti branched chain amino acids (BCAA) ni a gbé ga ní pàtàkì (Àwòrán 3A àti Àwòrán S5A), àti pé ọjà ìkẹyìn acetyl-CoA (CoA) tàbí succinyl CoA le ṣe àfikún tricarboxylates nínú ìyípo arteriosclerosis Acid (TCA). A rí i pé àkóónú BCAA transaminase 1 (BCAT1) àti BCAT2 pọ̀ sí i. Wọ́n ń ṣe ìdàgbàsókè ìgbésẹ̀ àkọ́kọ́ ti catabolism BCAA nípa ṣíṣe glutamate láti inú α-ketoglutarate (26). Gbogbo awọn apakan ti o ṣe akojọpọ keto acid dehydrogenase (BCKD) ti o ni ẹka ẹka ni a ṣe atunṣe (apapo naa n ṣe iranlọwọ fun decarboxylation atẹle ati ti ko le yipada ti egungun erogba BCAA ti o jẹyọ) (Aworan 3A ati Aworan S5A). Sibẹsibẹ, ko si awọn iyipada ti o han gbangba ninu BCAA funrararẹ ni a rii ninu PN ti a ṣeto, eyiti o le jẹ nitori ilosoke ninu gbigba sẹẹli ti awọn amino acids pataki wọnyi tabi lilo awọn orisun miiran (glucose tabi lactic acid) lati ṣe afikun iyipo TCA (Aworan S5B). Awọn PN ti ko ni OXPHOS tun fihan idinku glutamine ati awọn iṣẹ transamination ni ọsẹ mẹjọ ti ọjọ-ori, eyiti o le ṣe afihan nipasẹ igbesoke ti awọn enzymes mitochondrial glutaminase (GLS) ati glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Aworan 3, A ati C). Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé ìdàgbàsókè GLS ní ààlà sí isoform glutaminase C (GLS-GAC) tí a pín sí wẹ́wẹ́ (ìyípadà Mfn2cKO/CTRL jẹ́ nǹkan bí ìlọ́po 4.5, P = 0.05), àti pé ìdàgbàsókè pàtó rẹ̀ nínú àwọn àsopọ àrùn jẹjẹrẹ lè ṣètìlẹ́yìn fún agbára ìṣiṣẹ́ mitochondrial. (27).
(A) Maapu ooru fihan iyipada iyipo ninu ipele amuaradagba fun ipa ọna ti a sọ ni ọsẹ mẹjọ. (B) Àpẹẹrẹ ti ege cerebellar ti a fi anti-PCx antibody ṣe ami si (ọpa iwọn, 20 μm). Ọfà ofeefee naa tọka si ara sẹẹli Purkinje. (C) Itupalẹ ikosile amuaradagba akoko ti a fihan bi oludije pataki fun atherosclerosis (ọpọlọpọ idanwo t, *FDR <5%; n = eku 3-5). (D) Lókè: Aworan apẹrẹ ti o fihan awọn ọna oriṣiriṣi ti titẹ erogba ti a samisi ti o wa ninu [1-13C]pyruvate tracer (iyẹn ni, nipasẹ PDH tabi ipa ọna trans-arterial). Isalẹ: Atẹjade violin fihan ipin ogorun erogba ti a samisi kanṣoṣo (M1) ti a yipada si aspartic acid, citric acid ati malic acid lẹhin ti o samisi awọn ege cerebellar acute pẹlu [1-13C]pyruvate (idanwo t-paired; ** P <0.01). (E) Itupalẹ itan akoko ti o peye ti ipa ọna ti a fihan. Ronu nikan awọn amuaradagba pẹlu P<0.05 ni ọsẹ mẹjọ. Ìlà onílà dídà: kò sí iye àtúnṣe (ìṣàyẹ̀wò ìyàtọ̀ ọ̀nà méjì; * P <0.05; *** P <0.001). A ń fi àwọn dátà hàn gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n ± SEM.
Nínú ìwádìí wa, ìyípadà BCAA ti di ọ̀kan lára ​​​​àwọn ipa ọ̀nà pàtàkì láti mú kí ara gbóná. Òtítọ́ yìí fihàn gbangba pé ìwọ̀n afẹ́fẹ́ tí ń wọ inú ìyípo TCA le yípadà nínú PN tí kò ní OXPHOS. Èyí lè dúró fún irú pàtàkì kan ti ìyípadà ìṣiṣẹ́ neuronal, èyí tí ó lè ní ipa tààrà lórí ìṣiṣẹ́ neuronal àti ìwàláàyè nígbà tí a bá ń ṣe àtúnṣe àìṣiṣẹ́ OXPHOS tí ó le koko. Gẹ́gẹ́ bí àbá yìí, a rí i pé enzyme anti-atherosclerotic PCx ni a ń ṣàkóso (Mfn2cKO/CTRL ń yípadà ní nǹkan bí ìgbà 1.5; Àwòrán 3A), èyí tí ó ń ṣe ìyípadà pyruvate sí oxaloacetate (28), èyí tí a gbàgbọ́ pé ó wà nínú àsopọ ọpọlọ. Ìfihàn in ni a fi sí àwọn astrocytes (29, 30). Ní ​​ìbámu pẹ̀lú àwọn àbájáde proteomics, confocal microscopy fihàn pé ìfihàn PCx pọ̀ sí i ní pàtó àti ní pàtàkì nínú àwọn PN tí kò ní OXPHOS, nígbà tí ìṣiṣẹ́ PCx wà ní ìkángun sí àwọn sẹ́ẹ̀lì glial Bergmann tí ó wà ní ẹ̀gbẹ́ ti ìṣàkóso (Àwòrán 3B). Láti dán ìdàgbàsókè PCx wò dáadáa, a fi [1-13C]pyruvate tracer tọ́jú àwọn ègé cerebellar tó lágbára. Nígbà tí pyruvate dehydrogenase (PDH) sọ pyruvate di oxidized, àmì isotope rẹ̀ pòórá, Ṣùgbọ́n a fi sínú àwọn àárín ìyípo TCA nígbà tí pyruvate bá di metabolized nípasẹ̀ àwọn ìṣesí iṣan ara (Àwòrán 3D). Ní ​​àtìlẹ́yìn fún àwọn ìwádìí proteomics wa, a kíyèsí ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn àmì láti inú tracer yìí nínú aspartic acid ti àwọn ègé Mfn2cKO, nígbà tí citric acid àti malic acid náà ní ìtẹ̀síwájú díẹ̀, bó tilẹ̀ jẹ́ pé wọn kò ṣe pàtàkì (Àwòrán 3D).
Nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì dopamine ti àwọn eku MitoPark tí wọ́n ní ìṣòro mitochondria tí dopamine neurons fà tí ó pa mitochondrial transcription factor A gene (Tfam) run (Àwòrán S6B), ìfarahàn PCx tún ga síi ní pàtàkì (31), èyí tí ó fihàn pé acetone acid arteriosclerosis. Ìṣẹ̀lẹ̀ àrùn náà ni a ń ṣàkóso nígbà tí àrùn neuronal OXPHOS bá ṣiṣẹ́ nínú ara. Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé a ti rí i pé àwọn enzymes àrà ọ̀tọ̀ (32-34) tí a lè fihàn nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó lè níí ṣe pẹ̀lú arteriosclerosis ti ga síi ní pàtàkì nínú àwọn PN tí kò sí nínú OXPHOS, bíi propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA yí propionyl-CoA padà sí succinyl-CoA àti mitochondrial malic enzyme 3 (ME3), tí ipa pàtàkì rẹ̀ ni láti gba pyruvate padà láti inú malate (Àwòrán 3, A àti C) (33, 35). Ní àfikún, a rí ìbísí pàtàkì nínú enzyme Pdk3, èyí tí ó ń mú kí PDH ṣiṣẹ́, tí ó sì ń pa á run (36), nígbà tí a kò rí ìyípadà kankan nínú enzyme Pdp1 tí ó ń mú kí PDH tàbí enzyme PDH fúnrarẹ̀ ṣiṣẹ́ (Àwòrán 3A). Ní ​​ìbámu pẹ̀lú èyí, nínú Mern2cKO PNs, phosphorylation ti α1 subunit α (PDHE1α) subunit ti pyruvate dehydrogenase E1 complex ti PDH complex ni Ser293 (tí a mọ̀ sí dídí iṣẹ́ enzyme PDH lọ́wọ́) ni a mú sunwọ̀n sí i (Àwòrán S6C) (Àwòrán S6C). Pyruvate kò ní ìwọ̀sí iṣan ara.
Níkẹyìn, a rí i pé ipa ọ̀nà gíga ti serine àti glycine biosynthesis, mitochondrial folate (1C) cycle àti proline biosynthesis (Àwòrán 1G àti Àwòrán S5C) ni a ṣe àtúnṣe rẹ̀ ní pàtàkì, gẹ́gẹ́ bí àwọn ìròyìn ṣe sọ, nígbà tí a ń ṣiṣẹ́. Àwọn àsopọ̀ tí ó yí i ká ni a ń ṣiṣẹ́ pẹ̀lú àìṣiṣẹ́ mitochondrial (5-7). Ìwádìí Confocal tí ó ń ṣe àtìlẹ́yìn fún àwọn ìwádìí proteomics wọ̀nyí fihàn pé nínú PN pẹ̀lú OXPHOS tí kò sí, àwọn ègé cerebellar ti àwọn eku ọ̀sẹ̀ mẹ́jọ ni a fi serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2) ṣe, enzyme pàtàkì kan ti mitochondrial folate cycle. Ìdáhùn ààbò pàtàkì (Àwòrán S5D). Nínú àwọn ègé cerebellar 13 tí a fi CU-glucose-incubated acute cerebellar, àwọn àyẹ̀wò ìṣàfihàn metabolic tún jẹ́rìí sí ìdàgbàsókè ti serine àti proline biosynthesis, èyí tí ó fihàn pé ìṣàn ti carbon isoforms sínú serine àti proline pọ̀ sí i (Àwòrán S5E). Níwọ́n ìgbà tí àwọn ìṣesí tí GLS àti GPT2 gbé lárugẹ ló ń fa ìṣẹ̀dá glutamate láti inú glutamine àti ìyípadà láàrín glutamate àti α-ketoglutarate, ìdàgbàsókè wọn fihàn pé àwọn neuron tí kò ní OXPHOS ní ìbéèrè tó pọ̀ sí i fún glutamate. Èyí lè jẹ́ láti máa mú kí bíosynthesis ti proline pọ̀ sí i (Àwòrán S5C). Ní ​​ìyàtọ̀ sí àwọn àyípadà wọ̀nyí, ìwádìí proteomic ti àwọn astrocytes cerebellar láti inú àwọn eku Mfn2cKO pàtó kan tí a ń pè ní PN fihàn pé àwọn ipa ọ̀nà wọ̀nyí (pẹ̀lú gbogbo àwọn antiperoxidases) kò yí padà ní pàtàkì nínú ìfihàn, èyí sì ń fi hàn pé ìyípadà ìṣelọ́pọ́ yìí jẹ́ yíyàn sí PN tí ó ti bàjẹ́ (Àwòrán S6, D sí G).
Ní àkótán, àwọn ìwádìí wọ̀nyí fi àwọn ìlànà tó yàtọ̀ síra hàn ti ìṣiṣẹ́ àkókò ti àwọn ipa ọ̀nà ìṣiṣẹ́ pàtó nínú PNs. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé iṣẹ́ mitochondrial neuronal tí kò dára lè yọrí sí atherosclerosis ìbẹ̀rẹ̀ àti àtúnṣe 1C (Àwòrán 3E àti Àwòrán S5C), àti àwọn àyípadà tí a lè sọtẹ́lẹ̀ nínú ìfarahàn àwọn complexes I àti IV, àwọn àyípadà nínú ìṣẹ̀dá serine de novo nìkan ni ó hàn gbangba ní àwọn ìpele ìkẹyìn. Àìṣiṣẹ́ OXPHOS (Àwòrán 3E àti Àwòrán S5C). Àwọn àwárí wọ̀nyí túmọ̀ sí ìlànà kan tí mitochondrial tí ó fa wahala (1C cycle) àti cytoplasmic (serine biosynthesis) ń dáhùn pẹ̀lú ìbísí atherosclerosis nínú ìṣiṣẹ́ TCA láti tún ṣe àtúnṣe ìṣiṣẹ́ neuronal.
Àwọn PN tí kò ní OXPHOS tó jẹ́ ọ̀sẹ̀ mẹ́jọ lè máa ṣiṣẹ́ ìtara ìgbóná ara tó ga, kí wọ́n sì tún máa ṣe àtúnṣe ìṣiṣẹ́ ara tó ṣe pàtàkì láti san àbùkù fún àìṣiṣẹ́ mitochondrial. Àwárí yìí mú kí ó ṣeé ṣe pé ní àkókò yìí pàápàá, àwọn sẹ́ẹ̀lì wọ̀nyí lè gba ìtọ́jú láti dá ìdààmú ara dúró tàbí láti dènà ìṣiṣẹ́ ara. Láìpẹ́. A yanjú èyí nípasẹ̀ àwọn ìtọ́jú méjì tí kò ní ìyípadà. Nínú ọ̀nà àkọ́kọ́, a ṣe àgbékalẹ̀ fáírọ́ọ̀sì tí ó ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú adeno (AAV) tí ó jẹ́ Cre-dependent adeno-associated vector kí MFN2 lè hàn ní àwọn PN tí kò ní OXPHOS nínú vivo (Àwòrán S7A). A fìdí ìṣàfihàn AAV MFN2 àti ìran oníròyìn fluorescent mCherry (Mfn2-AAV) múlẹ̀ nínú àwọn àṣà neuron àkọ́kọ́ in vitro, èyí tí ó mú kí MFN2 hàn ní ọ̀nà tí ó dúró lórí Cre, ó sì gba ìrísí mitochondrial sílẹ̀, nípa bẹ́ẹ̀ ó ń dènà ìyípadà nínú neuron Mfn2cKO (Àwòrán S7, B, D àti E). Lẹ́yìn náà, a ṣe àwọn àyẹ̀wò in vivo láti fi Mfn2-AAV ọmọ ọ̀sẹ̀ mẹ́jọ sí cerebellar cortex ti Mfn2cKO àti ìṣàkóso àwọn eku, a sì ṣe àyẹ̀wò àwọn eku ọ̀sẹ̀ mẹ́jìlá (Àwòrán 4A). Àwọn eku Mfn2cKO tí a tọ́jú kú (Àwòrán 1, A àti B) (16). Ìyípadà viral in vivo yọrí sí ìfarahàn PN nínú àwọn iyika cerebellar kan (Àwòrán S7, G àti H). Abẹ́rẹ́ AAV ìṣàkóso tí ó ń fi mCherry (Ctrl-AAV) nìkan hàn kò ní ipa pàtàkì lórí ìwọ̀n neurodegeneration nínú àwọn ẹranko Mfn2cKO. Ní ìyàtọ̀ sí èyí, ìwádìí àwọn Mfn2cKO tí a fi Mfn2-AAV ṣe fihàn ipa ààbò pàtàkì ti fẹlẹfẹlẹ sẹ́ẹ̀lì PN (Àwòrán 4, B àti C). Ní ​​pàtàkì, ó dàbí pé ìwọ̀n neuron kò ṣeé yà sọ́tọ̀ kúrò lára ​​àwọn ẹranko ìṣàkóso (Àwòrán 4, B àti C, àti Àwòrán S7, H àti I). Ìfarahàn MFN1 ṣùgbọ́n kìí ṣe MFN2 jẹ́ ohun tó gbéṣẹ́ ní gbígbà ikú àwọn sẹ́ẹ̀lì ọpọlọ là (Àwòrán 4C àti Àwòrán S7, C àti F), èyí tó fihàn pé ìfarahàn ectopic MFN1 lè ṣàfikún àìní MFN2 dáadáa. Ìṣàyẹ̀wò síwájú síi ní ìpele PN kan fihàn pé Mfn2-AAV gba agbára mitochondria sílẹ̀, ó ti ṣe àtúnṣe àwọn ìpele mtDNA, ó sì yí ìfarahàn gíga ti àmì anti-angiogenesis PCx padà (Àwòrán 4, C sí E). Àyẹ̀wò ojú àwọn eku Mfn2cKO tí a gbà là ní ipò ìsinmi fihàn pé ìdúró wọn àti àwọn àmì ìṣiṣẹ́ wọn (ìṣípo S1 sí S3) ti sunwọ̀n síi. Ní ìparí, àwọn àyẹ̀wò wọ̀nyí fihàn pé ìfàsẹ́yìn MFN2 sínú PNs tí ó kéré gidigidi nínú OXPHOS tó láti yí ìlò mtDNA padà kí ó sì fa atherosclerosis, nípa bẹ́ẹ̀ ó ń dènà ìbàjẹ́ axon àti ikú neuronal ní vivo.
(A) Ètò kan tí ó ń fi ìṣètò ìdánwò hàn fún abẹ́rẹ́ AAV tí ó ń ṣàkójọ MFN2 nígbà tí ipa ọ̀nà ìṣiṣẹ́ tí a tọ́ka sí bá ṣiṣẹ́. (B) Àwọn àwòrán confocal tí ó dúró fún àwọn ègé cerebellar ọ̀sẹ̀ 12 tí a yọ jáde ní ọ̀sẹ̀ 8 nínú àwọn eku Mfn2cKO tí a sì fi àmì sí i pẹ̀lú antibody anti-Calbindin. Ọ̀tún: Ìwọ̀n àwọn okùn axon. Ìwọ̀n axon zoom jẹ́ 450 àti 75 μm. (C) Òsì: Ìwọ̀n ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì Purkinje nínú ìyípo transduction AAV (AAV+) (ìwádìí ìyàtọ̀ ọ̀nà kan; n = eku 3). Ọ̀tún: ìwádìí focus mtDNA nínú PN tí a yọ jáde ní ọ̀sẹ̀ 12 (ìdánwò t tí kò ní ìṣọ̀kan; n = sẹ́ẹ̀lì 6 láti inú eku mẹ́ta). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Àwọn micrographs electron transmission aṣojú ti àwọn PN ti àwọn ẹ̀yà cerebellar Mfn2cKO tí a yọ jáde pẹ̀lú àwọn vector viral tí a tọ́ka sí. Ìbòjú aláwọ̀ pupa náà ṣàfihàn agbègbè tí àwọn dendrites gbé, àti onígun mẹ́rin aláwọ̀ ofeefee náà ṣàfihàn zoom tí a pèsè ní apá ọ̀tún; n dúró fún nucleus. Ìwọ̀n àwọ̀, 1μm. (E) fi àpẹẹrẹ àwọ̀ PCx hàn nínú PN tí a gbé jáde ní ọ̀sẹ̀ 12. Ìwọ̀n àwọ̀, 20μm. OE, ìfarahàn púpọ̀; FC, ìyípadà ìfọ́.
Níkẹyìn, a ṣe ìwádìí nípa ìjẹ́pàtàkì ìwàláàyè sẹ́ẹ̀lì tí peroxidase fà nínú àwọn PN tí wọ́n ti ní ìṣòro OXPHOS. A ṣẹ̀dá mCherry tí ó ń ṣàkójọ AAV-shRNA (short hairpin RNA) tí ó ń fojúsùn PCx mRNA àwo (AAV-shPCx), a sì fi abẹ́rẹ́ fáírọ́ọ̀sì náà tàbí ìdarí rẹ̀ tí a ti tàn kálẹ̀ (AAV-scr) sínú cerebellum ti àwọn eku Mfn2cKO. Abẹ́rẹ́ náà ni a ṣe ní ọ̀sẹ̀ kẹrin ọjọ́ orí (Àwòrán 5A) láti ṣe àṣeyọrí ìkọlù PCx tí ó munadoko ní àkókò tí ìfarahàn PCx pọ̀ sí i (Àwòrán 3C) àti pé ìpele sẹ́ẹ̀lì PN ṣì wà ní ipò kan (Àwòrán 1A). Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé pípa PCx (Àwòrán S8A) run ń yọrí sí ìyára ikú PN, èyí tí ó ní ààlà sí òrùka tí ó ní àkóràn (Àwòrán 5, B àti C). Láti lè lóye bí ìṣiṣẹ́ àwọn ipa ìṣiṣẹ́ ara ṣe ń wáyé tí ìṣàtúnṣe PCx ń mú wá, a kẹ́kọ̀ọ́ nípa ipò redox ti PNs lẹ́yìn tí PCx knockdown àti a fi AAV-mediated optical biosensor Grx1-roGFP2 hàn ní àkókò kan náà (Àwòrán S8, B sí D) láti ṣe àyẹ̀wò glutathione. Ìyípadà ìbátan ti agbára redox peptide (38). Lẹ́yìn náà, a ṣe ìwádìí onímọ̀ nípa ìfàmọ́ra lifetime imaging fluorescence two-photon (FLIM) nínú àwọn ẹ̀yà ọpọlọ onígbà ọ̀sẹ̀ méje ti Mfn2cKO tàbí àwọn ẹgbẹ́ ìdarí láti ṣàwárí àwọn ìyípadà tó ṣeé ṣe nínú ipò redox cytoplasmic lẹ́yìn tí a bá ti ṣàyẹ̀wò àwọn ipò FLIM (Àwòrán S8, E sí G). Ìwádìí náà fi ìbísí pàtàkì hàn nínú ipò oxidation ti PN Mfn2cKO kan ṣoṣo tí kò ní ìfihàn PCx, èyí tí ó yàtọ̀ sí àwọn neuron ìṣàkóso tàbí Mfn2cKO PNs tí ó ń sọ shRNA tí a ti yọ́ dànù nìkan (Àwòrán 5, D àti E). Nígbà tí ìṣàfihàn PCx dínkù, ìpín ogorun àwọn PN Mfn2cKO tí ó fi ipò oxidized gíga hàn pọ̀ sí i ní ìgbà mẹ́ta ju (Àwòrán 5E), èyí tí ó fihàn pé ìṣàtúnṣe PCx ń mú agbára redox àwọn neuron tí ó ti bàjẹ́ dúró.
(A) Ètò kan tí ó ń fi ìṣètò ìdánwò hàn fún fífi abẹ́rẹ́ sí abẹ́rẹ́ AAV tí ó ń ṣàkójọ shPCx nígbà tí ipa ọ̀nà ìṣiṣẹ́ tí a fihàn bá ti ṣiṣẹ́. (B) Àwọn fọ́tò confocal aṣojú ti àwọn ẹ̀yà cerebellar ọ̀sẹ̀ mẹ́jọ nínú àwọn eku Mfn2cKO tí a fà jáde tí a sì fi àmì sí i pẹ̀lú anti-calcineurin antibody ní ọ̀sẹ̀ mẹ́rin. Àmì ìwọ̀n, 450μm. (C) Ìwọ̀n ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì Purkinje nínú àwọn ìlopo tí a fà jáde AAV (ìwádìí ìyàtọ̀ ọ̀nà kan; n = eku 3 sí 4). A fihàn dátà gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n ±SEM; ***P<0.001. (D) Àwòrán FLIM aṣojú fi ìwọ̀n ìgbésí ayé àròpín ti PN ọ̀sẹ̀ 7 tí ó ń fihàn glutathione redox sensor Grx1-roGFP2 lábẹ́ àwọn ipò ìdánwò tí a fihàn. Ìpíndọ́gba LUT (àtẹ ìwárí): àkókò ìwaláàyè (nínú picoseconds). Àmì ìwọ̀n, 25μm. (E) Àwòrán histogram náà fi ìpínkiri àwọn iye ìgbésí ayé Grx1-roGFP2 láti (D) (n=158 sí 368 sẹ́ẹ̀lì nínú àwọn eku méjì lábẹ́ ipò kọ̀ọ̀kan hàn). Àtẹ páì tí ó wà lókè histogram kọ̀ọ̀kan: fi iye àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó ní iye ìgbésí ayé gígùn (pupa, oxidized) tàbí kúkúrú (bulu, dínkù) hàn, èyí tí ó ju 1 SD ti iye ìgbésí ayé apapọ nínú CTRL-AAV-scr. (F) Àwòrán tí a dámọ̀ràn fi ipa ààbò ti ìdàgbàsókè PCx neuronal hàn.
Ni gbogbo gbogbo, data ti a pese nibi fihan pe atunṣe ifihan ti MFN2 le gba PN ti o ti ni ilọsiwaju patapata pẹlu aipe OXPHOS ti o lagbara, idinku mtDNA ti o lagbara, ati irisi ista-like ti ko dara pupọ, nitorinaa pese ilọsiwaju ti nlọ lọwọ paapaa ninu awọn arun ti o ti ni ilọsiwaju. Isọdọtun neuro pese ẹri ti o yipada ti ipele ṣaaju iku sẹẹli. Iwọn iyipada iṣelọpọ yii ni a tun tẹnumọ nipasẹ agbara awọn neurons lati fa atherosclerosis (atunṣe iyipo TCA), eyiti o ṣe idiwọ ikosile PCx ninu awọn PN ti ko ni OXPHOS ati mu iku sẹẹli pọ si, nitorinaa o n ṣe ipa aabo (Aworan 5F).
Nínú ìwádìí yìí, a fi ẹ̀rí hàn pé ìdáhùn PNs sí àìṣiṣẹ́ OXPHOS ni láti para pọ̀ díẹ̀díẹ̀ sí àrùn atherosclerosis cycle TCA nípasẹ̀ ipa ọ̀nà ìṣiṣẹ́ ìyàtọ̀ tí àwọn ètò ìṣiṣẹ́ ti ń ṣiṣẹ́. A fi ọ̀pọ̀lọpọ̀ ọ̀nà àfikún hàn pé ìwádìí proteomic náà ní a sì fi hàn pé nígbà tí àìṣiṣẹ́ mitochondrial líle bá dojúkọ, àwọn neurons ní irú ìrọ̀rùn ìṣiṣẹ́ tí a kò mọ̀ tẹ́lẹ̀. Sí ìyàlẹ́nu wa, gbogbo ìlànà ìyípadà kò fi dandan ṣe àmì ipò ìṣiṣẹ́ tí ó tẹ̀lé neurodegeneration díẹ̀díẹ̀ àti láìyípadà, ṣùgbọ́n àwọn ìwádìí wa fihàn pé ó lè jẹ́ neuron ìtọ́jú kódà ní ìpele kí ó tó kú sẹ́ẹ̀lì. Ìwádìí yìí fihàn pé àwọn neurons ní ìwọ̀n ìrọ̀rùn ìṣiṣẹ́ nínú ara. Òtítọ́ yìí fihàn pé àtúnṣe MFN2 lẹ́yìn náà le yí ìfihàn àwọn àmì ìṣiṣẹ́ pàtàkì padà kí ó sì dènà ìbàjẹ́ PN. Ní ìdàkejì, ó ń dènà atherosclerosis ó sì ń mú kí àwọn iṣan ara yára. transsexual.
Ọ̀kan lára ​​àwọn àwárí tó fani mọ́ra jùlọ nínú ìwádìí wa ni pé àwọn PN tí kò ní OXPHOS lè yí ìṣiṣẹ́ TCA cycle formation padà nípa ṣíṣe àtúnṣe àwọn enzymu tó ń ru arteriosclerosis sókè ní pàtàkì. Ìtúnṣe ìṣiṣẹ́ jẹ́ ohun tó wọ́pọ̀ nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì àrùn jẹjẹrẹ, àwọn kan lára ​​wọn gbára lé glutamine láti fi kún àwọn intermediates cycle TCA láti mú àwọn tó ń dínkù jáde, èyí tó ń darí ẹ̀wọ̀n atẹ́gùn àti láti máa ṣe ìṣẹ̀dá àwọn ohun tó ń ṣáájú lipid àti nucleotide biosynthesis (39, 40). Ìwádìí kan tó ṣẹ̀ṣẹ̀ ṣe fi hàn pé nínú àwọn àsopọ ara tó ń ní ìṣòro OXPHOS, ìtúnṣe ìṣiṣẹ́ glutamine/glutamate tún jẹ́ ohun pàtàkì (5, 41), níbi tí ìtọ́sọ́nà tí glutamine ń gbà sínú ìṣiṣẹ́ TCA sinmi lórí Nítorí bí ìpalára OXPHOS ṣe le tó (41). Síbẹ̀síbẹ̀, àìsí ẹ̀rí tó ṣe kedere wà lórí ìbáradọ́gba èyíkéyìí nínú ìṣiṣẹ́ neuronal plasticity nínú ara àti ìbáramu rẹ̀ nínú àrùn náà. Nínú ìwádìí in vitro kan láìpẹ́ yìí, a fihàn pé àwọn neuron cortical primary ni wọ́n ń kó àwọn adágún glutamate jọ fún ìṣiṣẹ́ neurotransmission, nípa bẹ́ẹ̀ wọ́n ń gbé ìṣiṣẹ́ oxidative àti atherosclerosis lárugẹ lábẹ́ àwọn ipò stress metabolic (42). Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé lábẹ́ ìdíwọ́ oògùn ti enzyme cycle TCA succinate dehydrogenase, a gbàgbọ́ pé pyruvate carboxylation ń ṣe àkóso ìṣẹ̀dá oxaloacetate nínú àwọn neuron cerebellar granule tí a ti gbó (34). Síbẹ̀síbẹ̀, ìbáramu ti àwọn ilana wọ̀nyí sí àsopọ̀ ọpọlọ (níbi tí a gbàgbọ́ pé atherosclerosis wà ní ìkángun àwọn astrocytes) ṣì ní pàtàkì ti ara (43). Nínú ọ̀ràn yìí, ìwádìí wa fihàn pé àwọn PN tí OXPHOS bá bàjẹ́ nínú ara le yípadà sí ìbàjẹ́ BCAA àti pyruvate carboxylation, èyí tí ó jẹ́ orísun pàtàkì méjì ti àfikún ti àwọn intermediates pool TCA. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a ti dábàá àfikún ti catabolism BCAA sí ìṣiṣẹ́ agbára neuronal, ní àfikún sí ipa ti glutamate àti GABA fún neurotransmission (44), kò sí ẹ̀rí fún àwọn ilana wọ̀nyí ní vivo. Nítorí náà, ó rọrùn láti ṣe àbájáde pé àwọn PN tí kò ṣiṣẹ́ dáadáa le san án padà fún lílo àwọn intermediates TCA tí ilana ìṣàpọ̀ ń fà nípa mímú atherosclerosis pọ̀ sí i. Ní pàtàkì, a lè nílò àtúnṣe PCx láti mú kí ìbéèrè aspartic acid pọ̀ sí i, èyí tí a dámọ̀ràn nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ń pọ̀ sí i pẹ̀lú àìlera mitochondrial (45). Síbẹ̀síbẹ̀, ìwádìí wa nípa metabolomics kò fi àwọn ìyípadà pàtàkì hàn nínú ìpele ipò tí ó dúró ṣinṣin ti aspartic acid nínú Mfn2cKO PNs (Àwòrán S6A), èyí tí ó ṣeé ṣe kí ó ṣàfihàn onírúurú lílo ìṣẹ̀dá ti aspartic acid láàárín àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ń pọ̀ sí i àti àwọn neuron lẹ́yìn-mitotic. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ìlànà pípé ti ìtúnṣe PCx nínú àwọn neuron tí kò ṣiṣẹ́ dáadáa nínú vivo ṣì wà láti ṣe àfihàn, a fihàn pé ìdáhùn àìpé yìí kó ipa pàtàkì nínú mímú ipò redox ti àwọn neuron dúró, èyí tí a fihàn nínú àwọn ìwádìí FLIM lórí àwọn ègé cerebellar. Ní pàtàkì, dídínà PNs láti mú PCx tí ń pọ̀ sí i lè yọrí sí ipò tí ó ti di oxidized àti kí ó mú kí ikú sẹ́ẹ̀lì yára. Ìmúṣiṣẹ́ ìbàjẹ́ BCAA àti carboxylation ti pyruvate kì í ṣe ọ̀nà láti ṣe àpèjúwe àwọn àsopọ̀ ẹ̀gbẹ́ ti àìṣiṣẹ́ mitochondrial (7). Nítorí náà, wọ́n dàbí ohun pàtàkì ti àwọn neuron tí kò ní OXPHOS, kódà bí kì í ṣe ẹ̀yà ara nìkan, èyí tí ó ṣe pàtàkì fún ìṣiṣẹ́ neurodegeneration. .
Àrùn cerebellar jẹ́ irú àrùn neurodegenerative tí ó sábà máa ń hàn gẹ́gẹ́ bí ataxia, tí ó sì sábà máa ń ba PN jẹ́ (46). Àwọn neuron yìí ní ewu gidigidi sí àìṣiṣẹ́ mitochondrial nítorí pé ìbàjẹ́ wọn nínú àwọn eku tó láti mú ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn àmì àrùn motor jáde tí ó ṣe àpèjúwe spinocerebellar ataxia ènìyàn (16, 47, 48). Gẹ́gẹ́ bí ìròyìn ti sọ, àpẹẹrẹ eku transgenic pẹ̀lú ìran mutant kan ní í ṣe pẹ̀lú spinocerebellar ataxia ènìyàn, ó sì ní àìṣiṣẹ́ mitochondrial (49, 50), tí ó tẹnu mọ́ pàtàkì kíkẹ́kọ̀ọ́ nípa àwọn àbájáde àìtó OXPHOS nínú PNPH. Nítorí náà, ó dára jùlọ láti ya àwọn neuron aláìlẹ́gbẹ́ yìí sọ́tọ̀ kí a sì kẹ́kọ̀ọ́ wọn dáadáa. Síbẹ̀síbẹ̀, nítorí pé àwọn PN jẹ́ onímọ̀lára gidigidi sí ìfúnpá àti pé wọ́n jẹ́ ìpín díẹ̀ nínú gbogbo àwọn cell cerebellar, fún ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ìwádìí tí ó dá lórí omics, pípín wọn gẹ́gẹ́ bí cell gbogbo ṣì jẹ́ apá ìpèníjà. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ó fẹ́rẹ̀ẹ́ má ṣeé ṣe láti ṣàṣeyọrí àìní ìbàjẹ́ pátápátá ti àwọn irú sẹ́ẹ̀lì mìíràn (pàápàá jùlọ àwọn àsopọ̀ àgbàlagbà), a so ìgbésẹ̀ ìpínyà tó munadoko pọ̀ mọ́ FACS láti gba iye tó tó ti àwọn neuron tó lè ṣiṣẹ́ fún ìwádìí proteomics tó wà ní ìsàlẹ̀, a sì ní ìbòrí amuaradagba tó ga (tó tó 3000 proteins) ní ìfiwéra pẹ̀lú àkójọ ìwádìí tó wà ti gbogbo cerebellum (51). Nípa pípa agbára ìṣiṣẹ́ gbogbo sẹ́ẹ̀lì mọ́, ọ̀nà tí a pèsè níbí yìí kò fún wa láyè láti ṣàyẹ̀wò àwọn ìyípadà nínú àwọn ipa ọ̀nà ìṣiṣẹ́ nínú mitochondria nìkan, ṣùgbọ́n láti ṣàyẹ̀wò àwọn ìyípadà nínú àwọn ẹgbẹ́ cytoplasmic rẹ̀, èyí tí ó ń ṣe àfikún lílo àwọn àmì membrane mitochondrial láti mú kí irú sẹ́ẹ̀lì pọ̀ sí i. Ọ̀nà tuntun fún iye mitochondria nínú àwọn àsopọ̀ tó díjú (52, 53). Ọ̀nà tí a ṣàpèjúwe kì í ṣe pé ó ní í ṣe pẹ̀lú ìkẹ́kọ̀ọ́ àwọn sẹ́ẹ̀lì Purkinje nìkan, ṣùgbọ́n a lè lò ó ní ìrọ̀rùn fún èyíkéyìí irú sẹ́ẹ̀lì láti kojú àwọn ìyípadà ìṣiṣẹ́ nínú ọpọlọ tó ní àrùn, pẹ̀lú àwọn àpẹẹrẹ àìṣiṣẹ́ mitochondrial mìíràn.
Níkẹyìn, a ti ṣàwárí ìtọ́jú kan nígbà tí a bá ń ṣe àtúnṣe ìṣiṣẹ́ ara yìí tí ó lè yí àwọn àmì pàtàkì ti wahala sẹ́ẹ̀lì padà pátápátá kí ó sì dènà ìbàjẹ́ sẹ́ẹ̀lì ara. Nítorí náà, lílóye àwọn ipa iṣẹ́ ti àtúnṣe ìṣiṣẹ́ tí a ṣàlàyé níbí lè fúnni ní òye pàtàkì sí àwọn ìtọ́jú tí ó ṣeé ṣe fún mímú ìṣiṣẹ́ ara sẹ́ẹ̀lì dúró nígbà àìṣiṣẹ́ mitochondrial. Ìwádìí ọjọ́ iwájú tí a ṣe àgbékalẹ̀ rẹ̀ láti ṣàyẹ̀wò àwọn ìyípadà nínú ìṣiṣẹ́ ara sẹ́ẹ̀lì ọpọlọ mìíràn ni a nílò láti fi hàn pé ìlànà yìí ṣeé lò fún àwọn àrùn ọpọlọ mìíràn.
A ti ṣàlàyé àwọn eku MitoPark tẹ́lẹ̀ (31). A ti ṣàlàyé àwọn eku C57BL/6N pẹ̀lú àwọn jiini Mfn2 tí ó wà ní ẹ̀gbẹ́ loxP (18) a sì ti fi àwọn eku L7-Cre rékọjá wọn (23). Lẹ́yìn náà, a fi àwọn eku Mfn2loxP/Mfn2loxP homozygous méjì tí ó yọrí sí ìyọrísí náà rékọjá wọn láti mú àwọn èku Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) tí ó jẹ́ homozygous heterozygous knockouts jínì kan pàtó Purkinje jáde fún Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Nínú ìpín kan ti ìbáṣepọ̀, a ṣe àgbékalẹ̀ Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP allele (stop-mtYFP) nípasẹ̀ àwọn ìkọjá afikún (20). Gbogbo ìlànà ẹranko ni a ṣe ní ìbámu pẹ̀lú àwọn ìlànà ti Europe, ti orílẹ̀-èdè àti ti ilé-iṣẹ́, LandesamtfürNatur ti Umwelt àti Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Germany sì fọwọ́ sí i. Iṣẹ́ ẹranko tún tẹ̀lé ìtọ́sọ́nà ti European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations.
Lẹ́yìn tí wọ́n bá ti fa ìrora fún obìnrin tí ó lóyún náà, wọ́n ya ọmọ inú eku náà sọ́tọ̀ (E13). Wọ́n yọ cortex náà kúrò nínú Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) tí wọ́n fi 10 mM Hepes kún un, wọ́n sì fi Dulbecco's Modified Eagle's Medium tí ó ní papain (20 U/ml) àti cysteine ​​​​(1μg/ml) kún un. Wọ́n gbé àsopọ̀ náà sínú DMEM) kí wọ́n sì yọ́ ọ kúrò nípa jíjẹ enzymatic. Ml) ní 37°C fún ogún ìṣẹ́jú, lẹ́yìn náà wọ́n fi ẹ̀rọ lọ̀ ọ́ sínú DMEM tí wọ́n fi 10% serum ẹran ọmú ṣe. Wọ́n gbìn ín sórí àwọn ìbòrí gilasi tí wọ́n fi polylysine bò ní ìwọ̀n 2×106 fún oúnjẹ ìbílẹ̀ 6 cm tàbí ní ìwọ̀n 0.5×105 cells/cm2 fún ìwádìí àwòrán. Lẹ́yìn wákàtí mẹ́rin, wọ́n fi Neurobasal serum-free medium tí ó ní 1% B27 supplement àti 0.5 mM GlutaMax rọ́pò medium náà. Lẹ́yìn náà, a pa àwọn sẹ́ẹ̀lì náà mọ́ ní 37°C àti 5% CO2 ní gbogbo ìgbà ìdánwò náà, a sì fún wọn ní oúnjẹ lẹ́ẹ̀kan lọ́sọ̀ọ̀sẹ̀. Láti lè mú kí àtúnṣe nínú in vitro wáyé, a lo 3μl (àwo ìṣẹ̀dá 24-well) tàbí 0.5μl (àwo 24-well) ti vector kòkòrò àrùn AAV9 yìí láti tọ́jú àwọn sẹ́ẹ̀lì ní ọjọ́ kejì in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Adgene, nọ́mbà katalogi 105530-AAV9) àti AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Adgene, nọ́mbà katalogi 105545-AAV9).
A fi àmì sí Mfn1 àti Mfn2 complementary DNA (tí a rí láti inú Addgene plasmid #23212 àti #23213, lẹ́sẹẹsẹ) pẹ̀lú ìtẹ̀léra V5 (GKPIPNPLLGLDST) ní C-terminus, a sì fi mCherry pòpọ̀ mọ́ra nínú frame nípasẹ̀ ìtẹ̀léra T2A. Grx1-roGFP2 jẹ́ ẹ̀bùn láti ọ̀dọ̀ Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Nípa lílo àwọn ọ̀nà ìṣẹ̀dá ìṣẹ̀dá ìbílẹ̀, a fi ìṣẹ̀dá ìṣẹ̀dá ìṣẹ̀dá ìṣẹ̀dá sínú pAAV-CAG-FLEX-tdTomato backbone (Nọ́mbà ìtọ́kasí Addgene 28306) láti ṣe àwọn ìtẹ̀léra pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 àti pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. A lo irú ọgbọ́n kan náà láti ṣe ìṣẹ̀dá ìṣàkóṣo pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Láti ṣe ìṣẹ̀dá ìṣètò AAV-shPCx, a nílò ìṣẹ̀dá AAV plasmid kan (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), èyí tí ó ní ìtẹ̀lé DNA tí ó ń ṣàkójọ ìtọ́sọ́nà shRNA PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) Lábẹ́ ìṣàkóṣo ìṣàkóṣo U6, a lo mCherry lábẹ́ ìṣàkóṣo ìṣàkóṣo CMV. A ṣe ìṣẹ̀dá àwọn ìṣẹ̀dá AAV ìrànlọ́wọ́ gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè (Cell Biolabs). Ní kúkúrú, lo plasmid gbigbe kan tí ó gbé mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ní ìgbà díẹ̀. Ìyípadà àwọn sẹ́ẹ̀lì 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) tàbí Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) tí ó ń kó àwọn nǹkan jọ, àti kíkọ àwọn èròjà protein capsid àti èròjà protein AAV1. Pàkójọ plasmid plasmid, nípa lílo ọ̀nà calcium phosphate. A gba agbára fáírọ́ọ̀sì burúkú náà nípasẹ̀ àwọn ìyípo didi-thaw nínú ìwẹ̀ yìnyín/ethanol gbígbẹ àti àwọn sẹ́ẹ̀lì lysed nínú iyọ̀ phosphate buffered (PBS). A yọ́ AAV vector náà mọ́ nípa lílo àìsí ìyípadà iodixanol gradient ultracentrifugation (wákàtí 24 ní 32,000 rpm àti 4°C) a sì fi àlẹ̀mọ́ centrifugal Amicon ultra-15 ṣe àkójọpọ̀. Titer Genome ti AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genome copy (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX ni a wọ̀n gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀ (54), tí a wọ̀n pẹ̀lú real-time quantitative PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) àti AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
A yọ awọn neuron akọkọ kuro ninu PBS ti o tutu-tutu 1x, ti a fi pellet ṣe, lẹhinna a ṣe idapọmọra wọn ni 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer ti o ni phosphatase ati protease inhibitor (Roche). A ṣe iṣiro amuaradagba nipa lilo idanwo bicinchoninic acid (Thermo Fisher Scientific). Lẹhinna a ya awọn amuaradagba naa sọtọ nipasẹ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, lẹhinna a fi pa wọn mọ sori awo polyvinylidene fluoride (GE Healthcare). Di awọn aaye ti ko ṣe pataki ki o si fi antibody akọkọ sinu (wo Tabili S1 fun awọn alaye) ninu wara 5% ninu TBST (Tris-buffered saline pẹlu Tween), awọn igbesẹ fifọ ati antibody keji ninu TBST Incubate. Fi antibody akọkọ sinu ina ni alẹ ni +4°C. Lẹhin fifọ, lo antibody keji fun wakati meji ni iwọn otutu yara. Lẹhinna, nipa fifi blot kanna sinu aporo anti-β-actin kan, a jẹrisi fifuye kanna. Ṣíṣàwárí nípa lílo ìyípadà sí chemiluminescence àti mímú kí chemiluminescence (GE Healthcare) pọ̀ sí i.
Àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a ti gbìn tẹ́lẹ̀ lórí àwọn ìbòjú gilasi ni a fi 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS sí ní àkókò tí a yàn ní iwọ̀n otútù yàrá fún ìṣẹ́jú 10. A kọ́kọ́ fi 0.1% Triton X-100/PBS kún àwọn ìbòjú náà fún ìṣẹ́jú 5 ní iwọ̀n otútù yàrá, lẹ́yìn náà a fi blockaging buffer [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. Ní ọjọ́ kejì, a fi blocking buffer fọ àwọn ìbòjú náà, a sì fi fluorophore-conjugated secondary antibody tó yẹ sínú wọn fún wákàtí 2 ní iwọ̀n otútù yàrá; níkẹyìn, a fi PBS fọ àwọn àpẹẹrẹ náà dáadáa pẹ̀lú 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) tí a fi àwọ̀ dídì bò ó, lẹ́yìn náà a fi Aqua-Poly/Mount so wọ́n mọ́ ìbòjú microscope náà.
A fi abẹ́rẹ́ ketamine (130 mg/kg) àti xylazine (10 mg/kg) sínú ìhò inú, a sì fi carprofen analgesic (5 mg/kg) fún un ní abẹlẹ̀, a sì fi sínú ohun èlò ìtọ́jú ara (Kopf) tí a fi pádì gbígbóná sí. Fi agbárí náà hàn kí o sì lo ohun èlò ìtọ́jú eyín láti tẹ́ apá cerebellar cortex tí ó bá egungun mis mu (láti lambda: ìrù 1.8, ẹ̀gbẹ́ 1, tí ó bá lobules IV àti V mu). Lo abẹ́rẹ́ syringe tí ó tẹ̀ láti ṣẹ̀dá ihò kékeré kan nínú agbárí láti yẹra fún dídí ìṣàn ẹ̀jẹ̀ tí ó wà ní ìsàlẹ̀ lọ́wọ́. Lẹ́yìn náà, a fi abẹ́rẹ́ gilásì tín-tín tí a fà sínú ihò kékeré (láti -1.3 sí -1 ní ẹ̀gbẹ́ ventral ti dura mater), a sì fi 200 sí 300 nl AAV sínú micro-injector (Narishige) pẹ̀lú àwọn abẹ́rẹ́ afọwọ́ṣe (Narishige) ní ọ̀pọ̀ ìgbà ní ìfúnpá kékeré lórí àkókò díẹ̀ fún ìṣẹ́jú 10 sí 20. Lẹ́yìn ìfúnpọ̀ náà, gbé ìfúnpọ̀ náà sí i fún ìṣẹ́jú mẹ́wàá mìíràn kí kòkòrò àrùn náà lè tàn kálẹ̀ pátápátá. Lẹ́yìn tí a bá ti yọ ìfúnpọ̀ náà kúrò, a fi ìṣọ́ra tọ́jú awọ ara láti dín ìgbóná ọgbẹ́ kù kí ó sì jẹ́ kí ẹranko náà gbádùn. Wọ́n fi àwọn oògùn analgesic (caspofen) tọ́jú àwọn ẹranko náà fún ọjọ́ mélòó kan lẹ́yìn iṣẹ́ abẹ náà, nígbà tí a ń ṣe àyẹ̀wò ipò ara wọn dáadáa, lẹ́yìn náà a pa wọ́n ní àkókò tí a yàn. Gbogbo ìlànà ni a ṣe ní ìbámu pẹ̀lú ìlànà ilẹ̀ Europe, ti orílẹ̀-èdè àti ti àjọ, LandesamtfürNatur ti Umwelt àti Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Germany sì fọwọ́ sí i.
A fi ketamine (100 mg/kg) àti xylazine (10 mg/kg) pa àwọn ẹranko náà lára, a sì fi 0.1 M PBS sí ọkàn ní àkọ́kọ́, lẹ́yìn náà a fi 4% PFA sí ọkàn PBS. A gé àsopọ̀ náà, a sì fi 4% PFA/PBS sí i ní alẹ́ ní 4°C. A lo ọ̀bẹ tí ń mì tìtì (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) láti pèsè àwọn apá sagittal (nípọn 50 μm) láti inú ọpọlọ tí ó dúró ní PBS. Àyàfi tí a bá sọ ọ́ lọ́nà mìíràn, a ṣe àwọ̀ àwọn apá tí kò ní omi gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ lókè (13) ní iwọ̀n otútù yàrá, a sì ń rú wọn. Ní kúkúrú, àkọ́kọ́, a fi 0.5% Triton X-100/PBS sí àwọn ege tí a rí fún ìṣẹ́jú 15 ní iwọ̀n otútù yàrá; fún àwọn epitopes kan (Pcx àti Shmt2), nípa fífi tris-EDTA buffer sí 80°C (PH9) mú àwọn ege náà gbóná fún ìṣẹ́jú 25 dípò ìgbésẹ̀ yìí. Lẹ́yìn náà, a fi antibody àkọ́kọ́ sínú àwọn apá náà (wo Táblì S1) nínú ìdènà buffer (3% BSA/PBS) ní 4°C ní alẹ́ pẹ̀lú ìrúnkún. Ní ọjọ́ kejì, a fi ìdènà buffer fọ àwọn apá náà, a sì fi antibody kejì fluorophore-conjugated tó yẹ sínú rẹ̀ fún wákàtí méjì ní iwọ̀n otútù yàrá; ní ìkẹyìn, a fọ ​​àwọn apá náà dáadáa nínú PBS, a fi DAPI sí i, lẹ́yìn náà a fi ìfàmọ́ra AquaPolymount On a microscope ṣe é.
A lo ohun èlò ìwádìí laser confocal microscope (TCS SP8-X tàbí TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) tí a fi lésà funfun àti lésà ultraviolet diode 405 ṣe láti ya àwòrán àpẹẹrẹ náà. Nípa fífún fluorophore níṣìírí àti gbígbà àmì náà pẹ̀lú Hybrid Detector (HyDs), a lo sọ́fítíwè LAS-X láti kó àwọn àwòrán tí a kó jọ tí ó bá àyẹ̀wò Nyquist mu ní ipò ìtẹ̀léra: fún àwọn páànẹ́lì tí kì í ṣe oníwọ̀n, ó jẹ́ àwọn àmì agbára gíga (fún àpẹẹrẹ, nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì somatic àti àwọn dendrites) mtYFP) Lo HyD láti ṣàwárí iye àwọn PNs nínú ipò BrightR). A lo ẹnu ọ̀nà láti 0.3 sí 6 ns láti dín ìpìlẹ̀ kù.
Àwòrán àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a ti ṣètò ní àkókò gidi. Lẹ́yìn tí a bá ti ṣètò wọn ní Neurobasal-A medium tí ó ní àfikún B27 1% àti 0.5 mM GlutaMax, a fi èso wọn sínú àwọn sẹ́ẹ̀lì lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ lórí àwọn gíláàsì tí a fi poly-l-lysine bo (μ-Slide8 Well, Ibidi, nọ́mbà katalogi 80826), Lẹ́yìn náà, a ó pa á mọ́ ní 37°C àti 5% CO2 fún wákàtí kan láti jẹ́ kí àwọn sẹ́ẹ̀lì náà dúró. A ṣe àwòrán àkókò gidi lórí microscope oníṣẹ́ abẹ lésà Leica SP8 tí a fi lésà funfun, HyD, lẹ́ńsì oil objective 63×[1.4 nọ́mbà aperture (NA)] àti ìpele ìgbóná.
Wọ́n yára fi ẹ̀rọ carbon dioxide pa eku náà lára, wọ́n sì gé orí rẹ̀, wọ́n sì yára yọ ọ́pọ̀lọpọ̀ kúrò nínú agbárí rẹ̀, wọ́n sì gé e sí ìwọ̀n 200μm (fún ìwádìí àmì 13C) tàbí ìwọ̀n 275μm (fún àwọn ìwádìí fọ́tòn méjì) apá sagittal tí a fi àwọn ohun èlò wọ̀nyí kún. A fi àwọn ohun èlò wọ̀nyí kún un: 125 mM yìnyín tútù, carbon-saturated (95% O2 àti 5% CO2) Ca2 + omi cerebrospinal artificial (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucose, 0.5 mM CaCl2 àti 3.5 mM MgCl2 (ìfúnpá osmotic ti 310 sí 330 mmol). Gbe awọn ege ọpọlọ ti a gba lọ si yara ti o ti ni Ca2 + ACSF ti o ga julọ (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ati 2.0 mM MgCl2) alabọde) pH 7.4 ati 310 si 320 mmol).
Nígbà tí wọ́n ń ṣe àwòrán náà, wọ́n gbé àwọn ègé náà lọ sí yàrá àwòrán tí a yà sọ́tọ̀, wọ́n sì ṣe ìdánwò náà lábẹ́ ìfàmọ́ra ACSF tí ń lọ lọ́wọ́ ní ìwọ̀n otútù tí ó wà láàrín 32° sí 33°C. A lo ohun èlò ìwádìí laser multiphoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) tí a fi lẹ́nsì objective Leica 25x (NA 0.95, omi), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) fún àwòrán slice. Modulu FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM ti Grx1-roGFP2. A wọn awọn iyipada ninu ipo redox cytoplasmic ti PNs nipasẹ FLIM meji-photon ninu awọn ege ọpọlọ sagittal, nibiti biosensor Grx1-roGFP2 fojusi awọn PNs. Ninu fẹlẹfẹlẹ PN, a yan aaye gbigba ni ayika 50 si 80 μm ni isalẹ oju ilẹ gige lati rii daju pe PN ti o ṣeeṣe wa (iyẹn ni, aini eto beaded tabi awọn iyipada morphological neuronal lẹgbẹẹ awọn dendrites) ati sensọ roGFP2 positive double ati AAV encoding shRNA PCx tabi atẹle iṣakoso rẹ (mCherry ti o n ṣafihan kọọkan). Gba awọn aworan stack kan pẹlu zoom oni-nọmba 2x [iwọn igbi iwuri: 890 nm; 512 nm 512 pixels]. Wiwa: HyD inu, ẹgbẹ àlẹmọ fluorescein isothiocyanate (FITC)] ati iwọn aworan laarin iṣẹju 2 si 3 ni a lo lati rii daju pe a gba awọn photon to (1000 photons ni apapọ) fun ibamu curve. A ṣe ìfàmọ́ra ìwádìí Grx1-roGFP2 àti ìfìdí múlẹ̀ àwọn ipò FLIM nípa ṣíṣàyẹ̀wò iye ìgbésí ayé roGFP2 nígbà tí a bá ń fi 10 mM H2O2 tí ó jáde síta kún ACSF perfusion (láti mú kí ìfọ́sídásì pọ̀ sí i, èyí tí ó yọrí sí ìgbẹ̀yìn ayé), lẹ́yìn náà a fi 2 mM dithiothreitol kún un (ó dín ìwọ̀n ìdínkù kù, èyí tí ó yọrí sí ìdínkù nínú ìgbésí ayé) (Àwòrán S8, D sí G). Lo FLIMfit 5.1.1 sọ́fítíwètì láti ṣàyẹ̀wò àwọn àbájáde tí a rí, fi ìlà ìbàjẹ́ exponential kan ṣoṣo ti gbogbo àwòrán náà sí IRF tí a wọ̀n (iṣẹ́ ìdáhùn ohun èlò), àti χ2 jẹ́ nǹkan bí 1. Láti ṣírò ìgbésí ayé PN kan ṣoṣo, a fa ìbòjú tí ó yí ara iṣan ká pẹ̀lú ọwọ́, a sì lo ìwọ̀n ìgbésí ayé àpapọ̀ nínú ìbòjú kọ̀ọ̀kan fún ìwọ̀n.
Ìwádìí agbára Mitochondrial. Lẹ́yìn tí a fi 100 nM TMRM tí a fi kún ACSF tí a ti fún ní ìṣẹ́jú 30, a fi microscope oní-photon méjì wọn àwọn ìyípadà agbára mitochondrial ti PNs. A ṣe àwòrán TMRM nípa lílo ìwádìí tí ó ní 920 nm àti lílo HyD inú (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) láti kó àwọn àmì jọ; nípa lílo ìgbì ìgbóná ìtara kan náà ṣùgbọ́n nípa lílo HyD inú mìíràn (FITC :525/50) láti ya àwòrán mtYFP. Lo ohun èlò ìṣàyẹ̀wò àwòrán ImageJ láti ṣe àyẹ̀wò agbára mitochondrial ní ìpele sẹ́ẹ̀lì kan. Ní kúkúrú, a lo ìlànà plug-in: signal = min (mtYFP, TMRM) láti dá agbègbè mitochondrial tí ó fi àmì TMRM hàn ní Purkinje Somali nínú àwòrán confocal kan ṣoṣo ti ikanni tí ó báramu. Lẹ́yìn náà, a ó ṣe àyẹ̀wò agbègbè píksẹ́lì nínú ìbòjú tí ó yọrí sí, lẹ́yìn náà a ó ṣe àtúnṣe sí àwòrán ìpele kan ṣoṣo tí ó báramu ti ikanni mtYFP láti gba ìpín mitochondrial tí ó fi agbára mitochondria hàn.
A fi ẹ̀rọ Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) pa àwòrán náà run. Fún àwọn àwòrán táìlì tí a ti ṣàyẹ̀wò, a ṣe àtúnṣe táìlì kan ṣoṣo nípa lílo algoridimu ìránṣọ aládàáṣe tí software LAS-X pèsè. Lẹ́yìn ìṣàtúnṣe àwòrán, lo ImageJ àti Adobe Photoshop láti tẹ̀síwájú nínú iṣẹ́ àwòrán náà kí o sì ṣe àtúnṣe ìmọ́lẹ̀ àti ìyàtọ̀ ní ìbámu pẹ̀lú ara wọn. Lo Adobe Illustrator fún ìmúrasílẹ̀ àwòrán.
Ìṣàyẹ̀wò ìfọkànsí mtDNA. A ṣe ìṣírò iye àwọn èèmọ́ mtDNA lórí àwọn apá cerebellar tí a fi àwọn èròjà ara sí DNA sí nípa lílo microscope confocal. A ṣẹ̀dá agbègbè àfojúsùn kọ̀ọ̀kan fún ara sẹ́ẹ̀lì àti nucleus ti sẹ́ẹ̀lì kọ̀ọ̀kan, a sì ṣe ìṣirò agbègbè kọ̀ọ̀kan nípa lílo plug-in Multi Measure (sọ́fítíwọ́ọ̀kì ImageJ). Yọ agbègbè nuclear kúrò láti agbègbè sẹ́ẹ̀lì láti gba agbègbè cytoplasmic. Níkẹyìn, a lo plug-in Analyse Particles (sọ́fíwọ́ọ̀kì ImageJ) láti ṣe ìṣirò àwọn points DNA cytoplasmic tí ó ń fihàn mtDNA lórí àwòrán ààlà, a sì ṣe àtúnṣe àwọn èsì tí a rí sí àròpín PN ti àwọn eku CTRL. Àwọn èsì náà ni a fihàn gẹ́gẹ́ bí iye àpapọ̀ nucleosides fún sẹ́ẹ̀lì kọ̀ọ̀kan.
Ìṣàyẹ̀wò ìṣàfihàn amuaradagba. Lo àfikún ẹ̀rọ ìṣirò àwòrán ImageJ láti ṣe àyẹ̀wò ìṣàfihàn amuaradagba ní PN ní ìpele sẹ́ẹ̀lì kan ṣoṣo. Ní kúkúrú, nínú àwòrán confocal onípele kan ti ikanni tó báramu, nípasẹ̀ ìfojúsùn: signal = min (mtYFP, antibody), a máa dá agbègbè mitochondrial tó ń fi ìfaradà ara hàn sí antibody kan pàtó ní Purkina mọ̀. Lẹ́yìn náà, a máa ṣe ìwọ̀n agbègbè pixel nínú ìbòjú tó báramu, lẹ́yìn náà a máa ṣe déédé lórí àwòrán onípele kan tó báramu ti ikanni mtYFP mu láti gba ìpín mitochondrial ti protein tó báramu.
Ìṣàyẹ̀wò ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì Purkinje. A lo àfikún Cell Counter ti ImageJ láti ṣe àyẹ̀wò ìwọ̀n Purkinje nípa pípín iye sẹ́ẹ̀lì Purkinje tí a kà nípa gígùn òrùka cerebellar tí àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a kà wà nínú rẹ̀.
A ṣe àgbékalẹ̀ àti gbígbà àwọn àpẹẹrẹ. A fi àwọn ọpọlọ láti inú ẹgbẹ́ ìṣàkóso àti àwọn eku Mfn2cKO sínú 2% PFA/2.5% glutaraldehyde nínú 0.1 M phosphate buffer (PB), lẹ́yìn náà a ṣe àwọn apá coronal nípa lílo ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Sísanra 50 sí 60 μm). Lẹ́yìn náà, a fi PB buffer sínú 1% os tetraoxide àti 1.5% potassium ferrocyanide ní iwọ̀n otútù yàrá fún wákàtí kan. A fi omi tí a ti fọ̀ àwọn apá náà nígbà mẹ́ta, lẹ́yìn náà a fi 70% ethanol tí ó ní 1% uranyl acetate kùn wọ́n fún ìṣẹ́jú 20. Lẹ́yìn náà, a fi omi gbẹ àwọn apá náà nínú ọtí tí a ti tọ́jú, a sì fi Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, nọ́mbà katalogi 14040) láàrín àwọn àwòrán gilasi tí a fi silicon bo, àti ní ìparí ní 60°C Polymerize nínú ààrò fún wákàtí 48. A yan agbegbe cerebellar cortex, a sì gé àwọn apakan 50 nm ultratin lórí Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) a sì gé wọn lórí grid bàbà 2×1 mm tí a fi polystyrene fíìmù bo. A fi omi uranyl acetate 4% kun àwọn apa náà ní H2O fún ìṣẹ́jú mẹ́wàá, a fi H2O fọ̀ wọ́n ní ọ̀pọ̀ ìgbà, lẹ́yìn náà a fi Reynolds lead citrate nínú H2O fún ìṣẹ́jú mẹ́wàá, lẹ́yìn náà a fi H2O fọ̀ wọ́n ní ọ̀pọ̀ ìgbà. A fi micrographs ya pẹ̀lú transmission electron microscope Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) nípa lílo kámẹ́rà oni-nọ́ńbà TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Germany).
Fún àwọn eku tí AAV ti kó, a ya ọpọlọ wa sọ́tọ̀, a sì gé e sí apá sagittal tí ó nípọn 1 mm, a sì fi microscope fluorescence ṣe àyẹ̀wò cerebellum náà láti dá òrùka tí ó ní àkóràn AAV mọ̀ (ìyẹn ni, mCherry tí ń fihàn). Àwọn àyẹ̀wò tí a fi abẹ́rẹ́ AAV ṣe àbájáde iṣẹ́ transduction gíga ti fẹlẹfẹlẹ sẹ́ẹ̀lì Purkinje (ìyẹn ni pé ó fẹ́rẹ̀ẹ́ jẹ́ gbogbo ìpele) nínú ó kéré tán àwọn òrùka cerebellar méjì tí ó tẹ̀lé ara wọn ni a lò. A fi microdissected loop tí a fi AAV ṣe fún ìtọ́jú alẹ́ (4% PFA àti 2.5% glutaraldehyde nínú 0.1 M cocoate buffer) a sì tún ṣe àtúnṣe sí i. Fún ìfipamọ́ EPON, a fi 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem) fọ àsopọ tí a ti fi sí ipò tí ó wà, a sì fi 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) sínú 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem) fún wákàtí mẹ́rin, lẹ́yìn náà a fi wẹ̀ fún wákàtí méjì. A tún ṣe é ní ìgbà mẹ́ta pẹ̀lú 0.1 M cocamide buffer. Lẹ́yìn náà, a lo àwọn ìtẹ̀síwájú ethanol láti fi omi ethanol kọ̀ọ̀kan sínú ihò ní 4°C fún ìṣẹ́jú 15 láti mú kí àsopọ náà gbẹ. A gbé àsopọ náà sínú propylene oxide, a sì fi sínú EPON (Sigma-Aldrich) ní òru kan ní 4°C. Gbé àsopọ náà sínú EPON tuntun ní iwọ̀n otútù yàrá fún wákàtí méjì, lẹ́yìn náà a fi sínú rẹ̀ ní 62°C fún wákàtí 72. Lo ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) àti ọ̀bẹ diamond (Diatome, Biel, Switzerland) láti gé àwọn ìpín 70 nm ultratin, kí o sì fi 1.5% uranyl acetate bò ó fún ìṣẹ́jú 15 ní 37°C, kí o sì fi omi lead citrate bò ó fún ìṣẹ́jú 4. A ya àwọn micrograph electron nípa lílo JEM-2100 Plus transmission electron microscope (JEOL) tí a fi Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) àti DigitalMicrograph software (Gatan) ṣe. Fún ìwádìí, a gba àwọn mákírógíráàmù elektínọ́mù pẹ̀lú ìró 5000× tàbí 10,000× oní-nọ́mbà.
Ìṣàyẹ̀wò morphological ti mitochondria. Fún gbogbo àwọn ìṣàyẹ̀wò, a fi ọwọ́ ṣe àgbékalẹ̀ àwọn contours ti mitochondria kọ̀ọ̀kan nínú àwọn àwòrán oní-nọ́ńbà nípa lílo software ImageJ. A ṣe àgbékalẹ̀ àwọn morphological parameters tó yàtọ̀ síra. A ṣe àgbékalẹ̀ ìwọ̀n mitochondria gẹ́gẹ́ bí ìpín ogorun tí a rí nípa pípín gbogbo agbègbè mitochondrial ti sẹ́ẹ̀lì kọ̀ọ̀kan nípa agbègbè cytoplasm (agbègbè cytoplasm = agbègbè cell area-cell nucleus area) × 100. A ṣe ìṣirò yíká mitochondria pẹ̀lú fọ́múlá [4π∙(agbègbè/àyíká 2)]. A ṣe àgbékalẹ̀ morphology ti mitochondria a sì pín sí ẹ̀ka méjì (“tubular” àti “blister”) gẹ́gẹ́ bí àwọn ìrísí pàtàkì wọn.
Àgbéyẹ̀wò nọ́mbà àti ìṣàyẹ̀wò ìwọ̀n ara-ẹni/ìyàtọ̀. Lo sọfítíwèsì ImageJ láti fi ọwọ́ ṣe àgbékalẹ̀ àwọn ìlà ti ara-ẹni/ìyàtọ̀ nínú àwòrán oní-nọ́mbà. A ń ṣàfihàn agbègbè ara-ẹni/ìyàtọ̀ gẹ́gẹ́ bí ìpín-orí tí a ṣírò nípa pípín gbogbo agbègbè ìṣètò ara-ẹni/ìyàtọ̀ nínú sẹ́ẹ̀lì kọ̀ọ̀kan nípa agbègbè cytoplasm (agbègbè cytoplasm=agbègbè sẹ́ẹ̀lì-agbègbè nucleus) ×100. A ń ṣírò ìwọ̀n ara-ẹni/ìyàtọ̀ nípa pípín gbogbo nọ́mbà nípa iye àwọn ètò ara-ẹni/ìyàtọ̀ nínú sẹ́ẹ̀lì kọ̀ọ̀kan (ní ìbámu pẹ̀lú agbègbè cytoplasm) (agbègbè cytoplasmic = agbègbè sẹ́ẹ̀lì-agbègbè nucleus).
Sísàmì fún ìpínyà ara líle àti ìpèsè àpẹẹrẹ. Fún àwọn àyẹ̀wò tí ó nílò àmì sísàmì sísàmì sísàmì ọpọlọ onígbà díẹ̀, gbé àwọn ègé ọpọlọ onígbà díẹ̀ sí yàrá ìfàmọ́ra ṣáájú ìfàmọ́ra, èyí tí ó ní erogba onígbà díẹ̀ (95% O2 àti 5% CO2), Ca2 + ACSF gíga (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 àti 2.0 mM MgCl2, tí a ṣe àtúnṣe sí pH 7.4 àti 310 sí 320 mOsm), nínú èyí tí glucose jẹ́ 13 C 6- ìyípadà sísàmì ... Fún àwọn àyẹ̀wò tí ó nílò àmì pyruvate, gbé àwọn ẹ̀ka ọpọlọ onígbà díẹ̀ sí Ca2 + ACSF gíga (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 kí o sì fi 2.0mM MgCl2 kún un, ṣàtúnṣe sí pH 7.4 àti 310 sí 320mOsm), kí o sì fi 1mM 1-[1-13C]pyruvate kún un (Eurisotop, nọ́mbà katalogi CLM-1082). Fi àwọn ẹ̀ka náà sínú iná fún ìṣẹ́jú 90 ní 37°C. Ní ìparí àyẹ̀wò náà, a fi omi olómi (pH 7.4) tí ó ní 75 mM ammonium carbonate, kí a sì sọ àwọn ẹ̀ka náà di ọ̀kan nínú 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: omi. Lẹ́yìn tí wọ́n ti fi àwọn ẹ̀yà ara náà sínú yìnyín fún ìṣẹ́jú 30, wọ́n fi centrifuge sí àwọn àyẹ̀wò náà ní 21,000 g fún ìṣẹ́jú 10 ní 4°C, wọ́n sì gbẹ ohun tí ó mọ́ kedere náà nínú ohun èlò SpeedVac concentrator. Wọ́n tọ́jú pellet metabolite gbígbẹ tí ó jáde láti inú rẹ̀ ní -80°C títí di ìgbà tí wọ́n fi ṣe àyẹ̀wò náà.
Ìwádìí ì ... (55, 56). Ní ​​ìgbésẹ̀ àkọ́kọ́, a fi 10μl ti 100 mM sodium carbonate (Sigma-Aldrich) kún 20μl ti ìyọkúrò ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ìwádìí ì A fi àyẹ̀wò náà yípadà fún ìgbà díẹ̀, lẹ́yìn náà a fi centrifuge sí i ní 21,000 g fún ìṣẹ́jú márùn-ún ní 20°C. Gbé àwọ̀ tí a ti wẹ̀ mọ́ inú ìgò aláwòrán 2 ml pẹ̀lú ohun èlò ìṣàpẹẹrẹ onígun mẹ́rin (200 μl volume). A ṣe àyẹ̀wò àwọn àyẹ̀wò náà nípa lílo Acquity iClass ultra-high performance LC system (Waters) tí a so mọ́ Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) high-resolution precision mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Fún àyẹ̀wò, a fi 2μl ti àyẹ̀wò tí a ti yọ̀ jáde sínú ọ̀wọ̀n 100×1.0 mm high-strength silica T3 column (Waters) tí ó ní àwọn èròjà 1.8μm. Ìwọ̀n ìṣàn náà jẹ́ 100μl/min, ètò ìṣàfihàn náà sì ní buffer A (10 mM ammonium formate àti 0.15% formic acid nínú omi) àti buffer B (ACN). Ìwọ̀n ìṣàn náà nìyí: 0%B ní ìṣẹ́jú 0; 0%B. 0 sí 15% B ní ìṣẹ́jú 0 sí 0.1; 15 sí 17% B ní ìṣẹ́jú 0.1 sí 0.5; B ní 17 sí 55% ní ìṣẹ́jú 0.5 sí 14; B ní 55 sí 70% ní ìṣẹ́jú 14 sí 14.5; ní 14.5 sí 70 sí 100% B ní ìṣẹ́jú 18; 100% B ní ìṣẹ́jú 18 sí 19; 100 sí 0% B ní ìṣẹ́jú 19 sí 19.1; 0% B ní ìṣẹ́jú 19.1 sí 28 (55, 56). Ìwọ̀n ìṣàyẹ̀wò ibi-ìwọ̀n QE-HF ń ṣiṣẹ́ ní ipò ionization rere pẹ̀lú ìwọ̀n ibi-ìwọ̀n m/z (ìpíndọ́gba ìwúwo/àkójọ agbára) ti 50 sí 750. Ìpinnu tí a lò jẹ́ 60,000, àti àfojúsùn ion ìṣàkóso (AGC) tí a gbà jẹ́ 3×106, àti àkókò ion tí ó pọ̀ jùlọ jẹ́ 100 milliseconds. Orísun ionization electrospray (ESI) tí ó gbóná ń ṣiṣẹ́ ní voltage spray ti 3.5 kV, ìwọ̀n otútù capillary ti 250°C, afẹ́fẹ́ ìfọ́fọ́ ti 60 AU (àwọn ẹ̀rọ aláìdọ́gba), àti afẹ́fẹ́ ìfọ́fọ́ ti 20 AU. 250°C. A ṣètò lẹ́nsì S sí 60 AU.
Ìṣàyẹ̀wò chromatography-MS ti àwọn acids organic tí a fi àmì sí 13C. A ṣe àyẹ̀wò ìṣàyẹ̀wò metabolite tí ó kù (55μl) nípa lílo ètò chromatography ion Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) tí a so mọ́ QE-HF mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Ní ​​kúkúrú, a fi 5μl ti ìyọkúrò metabolite sínú ọ̀wọ́n Dionex IonPac AS11-HC tí a fi HPLC (2 mm×250 mm, ìwọ̀n patiku 4μm, Thermo Fisher Scientific) sínú ọ̀nà ìtẹ̀síwájú apá kan pẹ̀lú ìpíndọ́gba ìkún ti 1. ) Ọ̀wọ̀n olùṣọ́ Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). A ń pa ìwọ̀n otútù ọ̀wọ̀n náà mọ́ ní 30°C, a sì ṣètò autosampler sí 6°C. Lo káàtírì potassium hydroxide tí a pèsè pẹ̀lú omi tí a ti yọ kúrò láti ṣe ìpele potassium hydroxide nípasẹ̀ ẹ̀rọ amúṣẹ́dá eluent. Ìyàsọ́tọ̀ àwọn metabolites ní ìwọ̀n ìṣàn omi ti 380μl/min, ní lílo ìwọ̀n ìtẹ̀síwájú wọ̀nyí: ìṣẹ́jú 0 sí 3, 10 mM KOH; ìṣẹ́jú 3 sí 12, 10 sí 50 mM KOH; ìṣẹ́jú 12 sí 19, 50 sí 100 mM KOH; ìṣẹ́jú 19 sí 21, 100 mM KOH; ìṣẹ́jú 21 sí 21.5, 100 sí 10 mM KOH. A tún ṣe àtúnṣe sí ọ̀wọ̀n náà lábẹ́ 10 mM KOH fún ìṣẹ́jú 8.5.
A da àwọn metabolites tí a ti yọ jáde pọ̀ mọ́ ìṣàn afikun isopropanol 150μl/min lẹ́yìn ọ̀wọ̀n náà, lẹ́yìn náà a darí wọn sí spectrometer mass resolution gíga tí ó ń ṣiṣẹ́ ní ipò ionization odi. MS ń ṣe àkíyèsí ìwọ̀n ibi-ìwọ̀n láti m/z 50 sí 750 pẹ̀lú ìpinnu 60,000. A ṣètò AGC sí 1×106, a sì pa àkókò ion tí ó pọ̀ jùlọ mọ́ ní 100 ms. A ṣiṣẹ́ orísun ESI tí ó gbóná ní foliteji fífọ́ ti 3.5 kV. Àwọn ètò mìíràn ti orísun ion ni wọ̀nyí: iwọ̀n otutu capillary 275°C; ìṣàn gaasi sheath, 60 AU; ìṣàn gaasi auxiliant, 20 AU ní 300°C, àti ìṣètò lẹ́nsi S sí 60 AU.
Ìṣàyẹ̀wò dátà ti àwọn metabolites tí a fi àmì sí 13C. Lo sọfítíwè TraceFinder (ẹ̀yà 4.2, Thermo Fisher Scientific) fún ìṣàyẹ̀wò dátà ti ìpíndọ́gba isotope. A fi àdàpọ̀ ìtọ́kasí tí ó ṣeé gbẹ́kẹ̀lé fìdí ìdámọ̀ àdàpọ̀ kọ̀ọ̀kan múlẹ̀, a sì ṣe àyẹ̀wò rẹ̀ fúnra rẹ̀. Láti ṣe ìṣàyẹ̀wò ìṣàfihàn isotope, a fa agbègbè chromatogram ion tí a yọ jáde (XIC) ti isotope 13C kọ̀ọ̀kan (Mn) jáde láti inú [M + H] +, níbi tí n jẹ́ nọ́mbà erogba ti àdàpọ̀ ibi-àfojúsùn, tí a lò láti ṣe àyẹ̀wò amino acids tàbí [MH] + ni a lò láti ṣe àyẹ̀wò àwọn anions. Ìpéye ibi-iwọ̀n ti XIC kéré sí àwọn ìpín márùn-ún fún mílíọ̀nù kan, àti ìpéye RT jẹ́ ìṣẹ́jú 0.05. Ìṣàyẹ̀wò ìṣàfihàn ni a ṣe nípa ṣíṣírò ìpíndọ́gba isotope tí a rí kọ̀ọ̀kan sí àròpọ̀ gbogbo isotope ti àdàpọ̀ tí ó báramu. A fún àwọn ìpíndọ́gba wọ̀nyí gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n ìpíndọ́gba fún isotope kọ̀ọ̀kan, a sì sọ àwọn àbájáde náà gẹ́gẹ́ bí ìṣàfihàn ìpíndọ́gba molar (MPE), gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀ (42).
A fi ìpara neuron dídì náà sínú tútù 80% methanol (v/v), a sì fi sínú rẹ̀, a sì fi sínú rẹ̀ ní -20°C fún ìṣẹ́jú 30. A tún fi ìpara náà pò ó kí a sì dà á ní +4°C fún ìṣẹ́jú 30. A fi ìpara náà séńtírífù sí 21,000 g fún ìṣẹ́jú 5 ní 4°C, lẹ́yìn náà a kó ìpara tí ó jáde wá jọ, a sì gbẹ ẹ́ nípa lílo SpeedVac concentrator ní 25°C fún ìwádìí tí ó tẹ̀lé e. Gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ lókè, a ṣe ìwádìí LC-MS lórí àwọn amino acids ti àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a yà sọ́tọ̀. Nípa lílo TraceFinder (ẹ̀yà 4.2, Thermo Fisher Scientific), a ṣe ìwádìí data nípa lílo ìwọ̀n monoisotopic ti èròjà kọ̀ọ̀kan. A ṣe ìṣètò iye data metabolite nípa lílo package software preprocessCore (57).
Ìtọ́jú eku náà kíákíá ni wọ́n fi erogba oloro pa á, wọ́n sì gé orí rẹ̀, wọ́n yára yọ ọpọlọ rẹ̀ kúrò lórí agbárí, wọ́n sì lo ọ̀bẹ tí ó kún fún yìnyín (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) láti gé e sí àwọn apá sagittal 300 sí 375 μm. Ìmúdàgba erogba tútù (95% O2 àti 5% CO2) Ca2 + ACSF kékeré (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 àti 6.0 mM MgCl2 Ṣàtúnṣe sí pH 7.4 àti 310 sí 330 mOsm). Gbé àwọn ègé ọpọlọ tí a rí lọ sí yàrá kan tí ó ní Ca2 + ACSF tí ó ga jùlọ (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2 àti mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 àti 310 sí 320 mOsm). Tọ́jú àwọn ègé náà fún ìṣẹ́jú 20 sí 30 kí a lè dá wọn padà kí a tó ṣe àkọsílẹ̀ rẹ̀.
Gbigbasilẹ. Ipele microscope ti a pese pẹlu yara gbigbasilẹ ti o wa titi ati lẹnsi ohun elo inu omi 20x (Scientifica) ni a lo fun gbogbo awọn igbasilẹ. Awọn sẹẹli Purkinje ti o wa titi ni a ṣe idanimọ nipasẹ (i) iwọn ara, (ii) ipo anatomical ti cerebellum, ati (iii) ifihan ti jiini oniroyin fluorescent mtYFP. A fa pipette patch pẹlu resistance titari ti 5 si 11 megohms jade nipasẹ capillary gilasi borosilicate (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Germany) ati awọn pipette petele Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA. Gbogbo awọn igbasilẹ ni a ṣe nipasẹ ELC-03XS patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Germany), eyiti software Signal (version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) ṣakoso. A ṣe igbasilẹ idanwo naa ni oṣuwọn ayẹwo ti 12.5 kHz. A fi àlẹ̀mọ́ Bessel méjì tí a fi ń gé ìpele kúkúrú méjì tí a fi ń yọ́ àmì náà pẹ̀lú àwọn ìgbà tí a ti gé ìpele náà kúrò ní 1.3 àti 10 kHz lẹ́sẹẹsẹ. A máa ń fi ẹ̀rọ amplifier san agbára ìdènà membrane àti pipette padà. Gbogbo àwọn ìdánwò ni a ṣe lábẹ́ ìṣàkóso kámẹ́rà Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Germany), èyí tí sọ́fítíwọ́ọ̀kì Hokawo (ẹ̀yà 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germany) ń ṣàkóso.
Ṣíṣeto àti ìṣàyẹ̀wò gbogbo sẹ́ẹ̀lì déédéé. Lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ kí o tó ṣe àkọsílẹ̀, fi omi inú tí ó ní àwọn ohun wọ̀nyí kún pipette náà: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potassium gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) àti 10.0 mM creatinine phosphate ni a ṣe àtúnṣe sí pH 7.25, àti ìfúnpá osmotic náà jẹ́ 290 mOsm (sucrose). Lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ lẹ́yìn lílo agbára 0 pA láti fọ́ membrane náà, a wọn agbára membrane ìsinmi náà. A wọn resistance input nípa lílo hyperpolarized currents ti -40, -30, -20, àti -10 pA. Wọn iwọn idahun folti ki o lo òfin Ohm láti ṣírò resistance input. A kọ ìṣiṣẹ́ àìròtẹ́lẹ̀ sínú fólítìkì fún ìṣẹ́jú márùn-ún, a sì dá sPSC mọ̀ tí a sì wọn nínú Igor Pro (ẹ̀yà 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) nípa lílo ìwé àkọsílẹ̀ ìdámọ̀ aládàáṣe. A ń wọn ìlà IV àti ìṣàn ìdúróṣinṣin nípa mímú bátírì náà ní oríṣiríṣi agbára (bẹ̀rẹ̀ láti -110 mV) àti mímú fólítì náà pọ̀ sí i ní àwọn ìgbésẹ̀ 5 mV. A dán ìṣelọ́pọ́ AP wò nípa lílo ìṣàn depolarizing. Di sẹ́ẹ̀lì náà mú ní -70 mV nígbà tí a ń lo ìṣàn depolarizing current pulse. Ṣe àtúnṣe ìwọ̀n ìgbésẹ̀ ti ẹ̀rọ ìgbasílẹ̀ kọ̀ọ̀kan lọ́tọ̀ọ̀tọ̀ (10 sí 60 pA). Ṣírò ìṣàn AP tí ó pọ̀ jùlọ nípa kíka àwọn ìfà pulse tí ó fa ìṣàn AP tí ó ga jùlọ pẹ̀lú ọwọ́. A ṣe àyẹ̀wò ààlà AP nípa lílo àtúnṣe kejì ti ìṣàn depolarization pulse tí ó kọ́kọ́ fa AP kan tàbí jù bẹ́ẹ̀ lọ.
Ṣíṣe àgbékalẹ̀ àti ìṣàyẹ̀wò àpò tí a ti fọ́. Ṣe àkọsílẹ̀ àpò tí a ti fọ́ nípa lílo àwọn ìlànà ìṣàpẹẹrẹ. Lo pipette tí kò ní ATP àti GTP tí kò ní àwọn èròjà wọ̀nyí: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA àti 2 mM MgCl2, kí o sì ṣe àtúnṣe sí pH 7.2 (nípa lílo KOH). A yọ ATP àti GTP kúrò nínú omi inú ara láti dènà ìfàsẹ́yìn tí kò ní agbára lórí awọ ara sẹ́ẹ̀lì. A fi omi inú tí ó ní amphotericin kún pipette náà (tó tó 200 sí 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) láti gba àkọsílẹ̀ àpò tí a ti fọ́. A yọ́ Amphotericin nínú dimethyl sulfoxide (ìwọ̀n ìkẹyìn: 0.1 sí 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Ìwọ̀n DMSO tí a lò kò ní ipa pàtàkì lórí àwọn neuron tí a ṣe àyẹ̀wò rẹ̀. Nígbà tí wọ́n ń fi ẹ̀rọ ìfúnpá sí i, wọ́n ń ṣe àkíyèsí resistance ikanni (Ra) nígbà gbogbo, wọ́n sì bẹ̀rẹ̀ ìdánwò náà lẹ́yìn tí agbára Ra àti AP bá dúró ṣinṣin (ìṣẹ́jú 20-40). A ń wọn ìṣiṣẹ́ láìròtẹ́lẹ̀ nínú folti àti/tàbí current clamp fún ìṣẹ́jú 2 sí 5. A ṣe àgbéyẹ̀wò dátà nípa lílo Igor Pro (ẹ̀yà 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (ẹ̀yà 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) àti GraphPad Prism (ẹ̀yà 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Orílẹ̀-èdè Amẹ́ríkà). Láti lè dá àwọn AP tí kò ní ìyípadà mọ̀, a ń lo plug-in NeuroMatic v3.0c ti IgorPro. A ń dá àwọn AP mọ̀ láìròtẹ́lẹ̀ nípa lílo ààlà tí a fúnni, èyí tí a ń ṣàtúnṣe lẹ́yọ kọ̀ọ̀kan fún àkọsílẹ̀ kọ̀ọ̀kan. Nípa lílo àárín spike, pinnu ìyípadà spike pẹ̀lú ìyípadà spike tó pọ̀ jùlọ àti ìyípadà spike tó wọ́pọ̀.
Ìyàsọ́tọ̀ PN. Nípa ṣíṣe àtúnṣe sí ìlànà tí a tẹ̀ jáde tẹ́lẹ̀, a ti wẹ PNs mọ́ kúrò nínú cerebellum eku ní ìpele pàtó kan (58). Ní ​​kúkúrú, a gé cerebellum náà, a sì gé e sínú ohun èlò ìyapa tí ó tutù bíi yìnyín [láìsí HBSS Ca2+ àti Mg2+, a fi 20 mM glucose, penicillin (50 U/ml) àti streptomycin (0.05 mg/ml) kún un], lẹ́yìn náà a fi omi inú papain [HBSS, tí a fi 1-cysteine·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) àti deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml) kún un], a sì fi tọ́jú rẹ̀ fún ìṣẹ́jú 30 ní 30°C. Kókọ́ fọ àwọn àsọ ara náà nínú ohun èlò HBSS tí ó ní ìpara ẹyin (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) àti DNase (0.1 mg/ml) ní iwọ̀n otútù yàrá láti dènà jíjẹ enzymatic, lẹ́yìn náà nínú ohun èlò HBSS tí ó ní 20 mM glucose. Fi HBSS, penicillin (50 U/ml), streptomycin (0.05 mg/ml) àti DNase (0.1 mg/ml) tú àwọn sẹ́ẹ̀lì kan ṣoṣo jáde. A yọ ìdàpọ̀ sẹ́ẹ̀lì tí ó yọrí sí náà kúrò nípasẹ̀ ohun èlò ìṣàn sẹ́ẹ̀lì 70μm, lẹ́yìn náà a fi centrifugation (1110 rpm, 5 min, 4°C) tú àwọn sẹ́ẹ̀lì náà jáde, a sì tún fi wọ́n sínú ohun èlò ìṣàtúnṣe [HBSS, tí a fi 20 mM glucose, 20% fetal bovine) Serum, penicillin (50 U/ml) àti streptomycin (0.05 mg/ml)]; ṣe àyẹ̀wò bí sẹ́ẹ̀lì ṣe lè ṣiṣẹ́ dáadáa pẹ̀lú propidium iodide kí o sì ṣàtúnṣe ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì sí 1×106 sí 2×106 sẹ́ẹ̀lì/ml. Kí a tó fi sẹ́ẹ̀lì ìṣàn omi sí i, a máa ń yọ ìdádúró náà kúrò nípasẹ̀ ẹ̀rọ ìṣàn sẹ́ẹ̀lì 50 μm.
Sitomita sisan. A ṣe yíyàtọ̀ sẹ́ẹ̀lì ní 4°C nípa lílo ẹ̀rọ FACSAria III (BD Biosciences) àti sọftuwia FACSDiva (BD Biosciences, ẹ̀yà 8.0.1). A ṣe yíyàtọ̀ sẹ́ẹ̀lì nípa lílo nozzle 100 μm lábẹ́ ìfúnpá 20 psi ní ìwọ̀n ìṣẹ̀lẹ̀ ~2800/sẹ́yìn. Nítorí pé àwọn ìlànà gating ìbílẹ̀ (ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì, ìyàtọ̀ bimodal, àti àwọn ànímọ́ ìtúká) kò le rí i dájú pé PN yà sọ́tọ̀ tó tọ́ láti inú àwọn irú sẹ́ẹ̀lì mìíràn, a ṣètò ọgbọ́n gating ní ìbámu pẹ̀lú ìfiwéra taara ti ìgbóná YFP àti autofluorescence nínú mitoYFP+ ​​àti mitoYFP − Àwọn eku. YFP ní ìtara nípa fífi ìlà lesa 488 nm tan ìmọ́lẹ̀ sí àpẹẹrẹ náà, a sì rí àmì náà nípa lílo àlẹ̀mọ́ band band 530/30 nm. Nínú àwọn eku mitoYFP+, a tún lo agbára ìbátan ti jínì oníròyìn Rosa26-mitoYFP láti ṣe ìyàtọ̀ sí ara neuronal àti àwọn ègé axon. A fi lésà aláwọ̀ 561 nm yọ 7-AAD lẹ́nu, a sì fi àlẹ̀mọ́ bandpass 675/20 nm ṣe àwárí rẹ̀ láti yọ àwọn sẹ́ẹ̀lì tí wọ́n ti kú kúrò. Láti lè ya àwọn sẹ́ẹ̀lì astrocytes sọ́tọ̀ ní àkókò kan náà, a fi ACSA-2-APC ṣe àwọ̀ sẹ́ẹ̀lì náà, lẹ́yìn náà a fi ìlà lésà 640 nm ṣe ìtànṣán, a sì lo àlẹ̀mọ́ bandpass 660/20 nm láti ṣàwárí àmì náà.
A fi centrifugation (1110 rpm, iṣẹju 5, 4°C) pa àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a kó jọ, a sì tọ́jú wọn sí -80°C títí tí a ó fi lò wọ́n. A pín àwọn eku Mfn2cKO àti àwọn ọmọ aja wọn sí oríṣiríṣi ní ọjọ́ kan náà láti dín ìyàtọ̀ ìlànà kù. A ṣe ìgbékalẹ̀ àti ìwádìí ìwádìí FACS nípa lílo sọ́fítíwè FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Gẹ́gẹ́ bí a ti sọ lókè (59), a lo PCR àkókò gidi láti ya DNA kúrò nínú àwọn neurons tí a yà sọ́tọ̀ fún ìṣàyẹ̀wò mtDNA lẹ́yìn náà. A kọ́kọ́ dán ìfàmọ́ra ìlà àti ìfàmọ́ra ẹnu ọ̀nà wò nípa lílo qPCR lórí àwọn nọ́mbà sẹ́ẹ̀lì tó yàtọ̀ síra. Ní kúkúrú, kó 300 PN jọ nínú lysis buffer tí ó ní 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 àti proteinase K (200 ng/ml) kí o sì fi sínú iná ní 55°C fún ìṣẹ́jú 120. A tún fi sínú iná ní 95°C fún ìṣẹ́jú 10 láti rí i dájú pé proteinase K kò ṣiṣẹ́ dáadáa. Nípa lílo TaqMan probe (Thermo Fisher) tí ó ṣe pàtàkì sí mt-Nd1, a wọn mtDNA nípa lílo semi-quantitative PCR nínú ètò 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Ìmọ̀ sáyẹ́ǹsì, nọ́mbà àkójọpọ̀ Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nọ́mbà àkójọpọ̀ AIVI3E8) àti 18S (Thermo Fisher Scientific, nọ́mbà àkójọpọ̀ Hs99999901_s1) àwọn jínì.
Ìpèsè àyẹ̀wò Proteome. Nípa gbígbóná omi náà ní 95°C fún ìṣẹ́jú 10 àti sínótí, nínú lysis buffer [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide àti 100 mM tris-Lyse frozen neuron pellets nínú HCl]. Lórí Bioruptor (Diagenode) fún ìṣẹ́jú 10 (30 seconds pulse / 30 seconds sleep period). A fi 1:10 po ayẹwo náà nínú 20 mM tris-HCl (pH 8.0), a dapọ̀ mọ́ 300 ng trypsin gold (Promega), a sì fi sínú rẹ̀ ní alẹ́ ní 37°C láti lè jẹ oúnjẹ pátápátá. Ní ọjọ́ kejì, a fi centrifuge centrifuge sí 20,000 g fún ìṣẹ́jú 20. A fi 0.1% formic acid po omi náà, a sì fi StageTips tí a ṣe fúnra rẹ̀ pa omi náà mọ́. A gbẹ ayẹwo naa ninu ohun elo SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) ni iwọn otutu 45°C, lẹhinna a da peptide naa duro ni 0.1% formic acid. Gbogbo awọn ayẹwo ni a ṣe ni akoko kanna nipasẹ eniyan kanna. Lati ṣe itupalẹ awọn ayẹwo astrocyte, a fi aami tandem mass tag (TMT10plex, nọmba katalogi 90110, Thermo Fisher Scientific) samisi 4 μg awọn peptides desalted pẹlu ipin reagent peptide si TMT ti 1:20. Fun aami TMT, a tun fi 0.8 mg ti reagent TMT pada sinu 70 μl ti anhydrous ACN, a si tun ṣe atunṣe peptide ti o gbẹ sinu 9 μl ti 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate), eyiti a fi 7 μl ti reagent TMT ninu ACN kun. Iwọn naa jẹ 43.75%. Lẹhin iṣẹju 60 ti incubation, a pa iṣe naa pẹlu 2 μl ti 5% hydroxylamine. A kó àwọn peptide tí a fi àmì sí, a gbẹ wọ́n, a tún fi 200μl ti 0.1% formic acid (FA) ṣe, a pín wọn sí méjì, lẹ́yìn náà a fi iyọ̀ pa wọ́n nípa lílo StageTips tí a ṣe fúnra wa. Nípa lílo UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), a pín ọ̀kan nínú àwọn ìdajì méjì náà sí orí ọ̀wọ́n chromatographic Acquity 1mm x 150mm tí a fi àwọn èròjà C18 130Å1.7μm kún (Waters, catalog No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Ya àwọn peptide sọ́tọ̀ ní ìwọ̀n ìṣàn ti 30μl/min, ya sọ́tọ̀ láti 1% sí 50% buffer B fún ìṣẹ́jú 85 pẹ̀lú ìtẹ̀síwájú ìṣẹ́jú 96, láti 50% sí 95% buffer B fún ìṣẹ́jú 3, lẹ́yìn náà fún ìṣẹ́jú 8 fún 95% Buffer B; Ààbò A jẹ́ 5% ACN àti 10 mM ammonium bicarbonate (ABC), àti ààbò B jẹ́ 80% ACN àti 10 mM ABC. Ẹ kó àwọn ìpín jọ ní gbogbo ìṣẹ́jú mẹ́ta kí ẹ sì da wọ́n pọ̀ sí àwọn ẹgbẹ́ méjì (1 + 17, 2 + 18, àti bẹ́ẹ̀ bẹ́ẹ̀ lọ) kí ẹ sì gbẹ wọ́n nínú centrifuge onígbà díẹ̀.
Ìṣàyẹ̀wò LC-MS/MS. Fún ìwádìí ibi-ẹ̀rọ, a ya àwọn peptides (nọ́mbà r119.aq) sọ́tọ̀ lórí ìlà oníwọ̀n 25 cm, 75 μm PicoFrit (lẹ́ńsì tuntun, nọ́mbà apá PF7508250) tí a fi 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Dr. Maisch, mat), Lo EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germany). A ṣe ìtọ́jú ọ̀wọ̀n náà ní 50°C. Àwọn buffers A àti B jẹ́ 0.1% formic acid nínú omi àti 0.1% formic acid nínú 80% ACN, lẹ́sẹẹsẹ. A ya àwọn peptides sọ́tọ̀ láti 6% sí 31% buffer B fún ìṣẹ́jú 65 àti láti 31% sí 50% buffer B fún ìṣẹ́jú 5 pẹ̀lú gradient ti 200 nl/min. A ṣe àyẹ̀wò àwọn peptides tí a ti yọ jáde lórí Orbitrap Fusion mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). A ṣe ìwọ̀n peptide precursor m/z pẹ̀lú ìpinnu 120,000 láàárín 350 sí 1500 m/z. Nípa lílo agbára ìkọlù tó péye 27%, a yan precursor tó lágbára jùlọ pẹ̀lú ipò gbigba agbara ti 2 sí 6 fún ìyapa C trap tract (HCD) agbára gíga. A ṣètò àkókò cycle sí 1 s. A wọn iye m/z ti peptide fragment nínú ion trap nípa lílo ibi-afẹ́fẹ́ AGC tó kéré jùlọ ti 5×104 àti àkókò abẹ́rẹ́ tó pọ̀ jùlọ ti 86 ms. Lẹ́yìn ìyapa, a gbé precursor náà sí àkójọ ìyọkúrò oníyípadà fún 45 s. A ya àwọn peptide tí a fi àmì TMT sí orí ọ̀wọ́n Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, nọ́mbà katalogi 164942), a sì ṣe àyẹ̀wò àwọn ìṣíkiri ìjìnlẹ̀ lórí spectrometer Orbitrap Lumos Tribrid mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) tí a fi àwọn ions waveform high-field asymmetric (FAIMS) tí a fi sínú ẹ̀rọ (Thermo Fisher Scientific) tí ó ń ṣiṣẹ́ ní àwọn voltages àtúnṣe méjì ti −50 àti −70 V. A lo MS3 tí a yàn gẹ́gẹ́ bí ìlànà ìṣiṣẹ́pọ̀ fún ìwọ̀n àmì ion ìròyìn TMT. A ṣe ìyàsọ́tọ̀ peptide lórí EASY-nLC 1200, nípa lílo 90% linear gradient elution, pẹ̀lú ìfọkànsí buffer ti 6% sí 31%; buffer A jẹ́ 0.1% FA, àti buffer B jẹ́ 0.1% FA àti 80% ACN. A ń ṣiṣẹ́ ọ̀wọ̀n analytic náà ní 50°C. Lo FreeStyle (ẹ̀yà 1.6, Thermo Fisher Scientific) láti pín fáìlì àkọ́kọ́ náà gẹ́gẹ́ bí folti àtúnṣe FAIMS.
Ìdámọ̀ àti ìṣírò ìwọ̀n. Nípa lílo ẹ̀rọ ìwárí Andromeda tí a ṣepọ, a ṣe àyẹ̀wò àwọn ìwádìí àtilẹ̀wá nípa lílo MaxQuant version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Ní ​​àfikún sí àwọn ìtẹ̀lé Cre recombinase àti YFP tí a rí láti Aequorea victoria, a wá àwọn ìpele peptide fragment spectra fún ìtẹ̀lé canonical àti ìtẹ̀lé isoform ti proteome ìtọ́kasí eku (Proteome ID UP000000589, tí a gbà láti UniProt ní oṣù Karùn-ún ọdún 2017). A ṣètò oxidation Methionine àti protein N-terminal acetylation gẹ́gẹ́ bí àwọn àtúnṣe oníyípadà; a ṣètò cysteine ​​​​carbamoyl methylation gẹ́gẹ́ bí àwọn àtúnṣe tí a ti ṣe àtúnṣe. A ṣètò àwọn pàrámítà ìjẹun sí “specificity” àti “trypsin/P”. Iye tí ó kéré jùlọ ti àwọn peptides àti razer peptides tí a lò fún ìdámọ̀ amuaradagba jẹ́ 1; iye tí ó kéré jùlọ ti àwọn peptides aláìlẹ́gbẹ́ jẹ́ 0. Lábẹ́ àwọn ipò ìbáramu peptide map, ìwọ̀n ìdámọ̀ amuaradagba jẹ́ 0.01. A ti ṣiṣẹ́ àṣàyàn “Peptide Kejì”. Lo àṣàyàn “ìbáramu láàárín àwọn ìṣiṣẹ́” láti gbé àwọn ìdámọ̀ àṣeyọrí láàrín àwọn fáìlì àtilẹ̀wá tó yàtọ̀ síra. Lo iye ìpíndọ́gba LFQ tó kéré jùlọ 1 fún ìṣàyẹ̀wò láìsí àmì (LFQ) (60). A ṣe àlẹ̀mọ́ agbára LFQ fún ó kéré tán iye méjì tó wúlò nínú ó kéré tán ẹgbẹ́ genotype kan ní àkókò kọ̀ọ̀kan, a sì yọ ọ́ jáde láti inú ìpínkiri déédé pẹ̀lú ìbú 0.3 kí o sì lọ sí ìsàlẹ̀ 1.8. Lo ìpìlẹ̀ ìṣirò Perseus (https://maxquant.net/perseus/) àti R (https://r-project.org/) láti ṣe àyẹ̀wò àwọn àbájáde LFQ. A lo ìdánwò t oníwọ̀n méjì láti inú package software limma fún ìṣàyẹ̀wò ìṣàfihàn ìyàtọ̀ (61). A ṣe ìṣàyẹ̀wò dátà nípa lílo ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally àti pheatmap. A ṣe àyẹ̀wò dátà proteomics tí ó dá lórí TMT nípa lílo MaxQuant version 1.6.10.43. Wa data proteomics aise lati inu ibi ipamọ data proteomics ti UniProt, eyiti a gba lati ayelujara ni Oṣu Kẹsan ọdun 2018. Atunyẹwo naa pẹlu ifosiwewe atunse isotope mimọ ti olupese pese. Lo limma ni R fun itupalẹ ikosile iyatọ. Data atilẹba, awọn abajade wiwa ibi ipamọ data, ati iṣẹ ṣiṣe itupalẹ data ati awọn abajade gbogbo ni a tọju sinu ajọṣepọ ProteomeXchange nipasẹ ibi ipamọ alabaṣepọ PRIDE pẹlu idanimọ ṣeto data PXD019690.
Àwọn àtúnyẹ̀wò iṣẹ́ ń mú kí ìwádìí náà sunwọ̀n síi. A lo irinṣẹ́ Ìwádìí Ọ̀nà Ìmọ̀ràn (QIAGEN) láti mọ bí àwọn ọ̀rọ̀ àtúnyẹ̀wò iṣẹ́ ti dátà tí a ṣètò ní ọ̀sẹ̀ mẹ́jọ (Àwòrán 1). Ní ​​kúkúrú, àkójọ àwọn èròjà amuaradagba oníyebíye tí a rí láti inú ìwádìí dátà LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) ni a lò pẹ̀lú àwọn ìlànà àlẹ̀mọ́ wọ̀nyí: A yan Musculus gẹ́gẹ́ bí irú àti ẹ̀yìn, àti ẹ̀ka náà fi iye P tí Benjamini ṣe àtúnṣe fún ìdàgbàsókè 0.05 tàbí sísàlẹ̀ hàn gẹ́gẹ́ bí ohun pàtàkì. Fún àwòrán yìí, a fi àwọn ẹ̀ka márùn-ún tí ó ga jùlọ nínú ẹgbẹ́ kọ̀ọ̀kan tí ó dá lórí iye P tí a ṣe àtúnṣe hàn. Nípa lílo ìdánwò t-pupọ, nípa lílo ètò ìdàgbàsókè ìlà méjì ti Benjamini, Krieger, àti Yekutieli (Q = 5%), a ṣe ìwádìí àgbékalẹ̀ amuaradagba àkókò lórí àwọn olùdíje pàtàkì tí a dámọ̀ nínú ẹ̀ka kọ̀ọ̀kan, a sì ṣe àtúpalẹ̀ ìlà kọ̀ọ̀kan lọ́tọ̀ọ̀tọ̀. Kò sí ìdí láti gba SD tí ó dúró ṣinṣin.
Láti fi àwọn àbájáde ìwádìí yìí wéra pẹ̀lú àwọn ibi ìkópamọ́ ìpamọ́ tí a tẹ̀ jáde àti láti ṣe àwòrán Venn ní Àwòrán 1, a so àkójọ àwọn èròjà amuaradagba oníwọ̀n pọ̀ mọ́ àwọn àlàyé MitoCarta 2.0 (24). Lo irinṣẹ́ orí ayélujára Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) láti ṣe àwòrán náà.
Fún àlàyé kíkún lórí àwọn ìlànà ìṣirò tí a lò fún ìwádìí proteomics, jọ̀wọ́ wo apá tó báramu nínú Àwọn Ohun èlò àti Ọ̀nà. Fún gbogbo àwọn ìdánwò mìíràn, a lè rí àlàyé kíkún nínú ìtàn tó báramu. Àyàfi tí a bá sọ ọ́ ní ọ̀nà mìíràn, gbogbo dátà ni a sọ gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n ± SEM, a sì lo sọ́fítíwè GraphPad Prism 8.1.2 láti ṣe gbogbo ìwádìí ìṣirò.
Fún àwọn ohun èlò afikún fún àpilẹ̀kọ yìí, jọ̀wọ́ wo http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Àpilẹ̀kọ yìí jẹ́ ìwé tí a pín síta lábẹ́ àwọn òfin Creative Commons Attribution-Non-Commerce License, èyí tí ó fún lílo, pínpín àti àtúnṣe ní ọ̀nà èyíkéyìí, níwọ̀n ìgbà tí lílo ìkẹyìn kò bá jẹ́ fún èrè ìṣòwò àti pé àbá náà ni pé iṣẹ́ àtilẹ̀wá náà tọ́. Ìtọ́kasí.
Àkíyèsí: A kàn ń béèrè lọ́wọ́ rẹ láti fún ọ ní àdírẹ́sì ìmeeli rẹ kí ẹni tí o bá dámọ̀ràn sí ojú ìwé náà lè mọ̀ pé o fẹ́ kí wọ́n rí ìmeeli náà àti pé kì í ṣe àwúrúju. A kò ní gba àdírẹ́sì ìmeeli kankan.
A lo ibeere yii lati danwo boya alejo ni o ati lati dena ifisilẹ spam laifọwọyi.
Nipa E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Ìwádìí àwọn proteomics ti àwọn neurons aláìṣiṣẹ́ fi hàn pé àwọn ètò ìṣiṣẹ́ ara ni a ń ṣiṣẹ́ láti dènà neurodegeneration.
Nipa E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Ìwádìí àwọn proteomics ti àwọn neurons aláìṣiṣẹ́ fi hàn pé àwọn ètò ìṣiṣẹ́ ara ni a ń ṣiṣẹ́ láti dènà neurodegeneration.
©2020 Ẹgbẹ Amẹrika fun Ilọsiwaju ti Imọ. gbogbo awọn ẹtọ wa ni ipamọ. AAAS jẹ alabaṣepọ ti HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ati COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.