Àdírẹ́sì lọ́wọ́lọ́wọ́: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Ilé-iṣẹ́ ìkọ́lé ìmọ́lẹ̀ 1 (RC-LH1) ni apá pàtàkì fọ́tòsíntì ti bakitéríà fọ́tòfírófíkì aláwọ̀ elése. A ṣe àgbékalẹ̀ àwọn ìṣètò onímọ̀-ẹ̀rọ-ìmọ́lẹ̀ méjì ti ìṣètò RC-LH1 láti Rhodopseudomonas palustris. Ìṣètò ìpinnu 2.65-Å ti ìṣètò RC-LH114-W ní àwọn ìṣètò LH1 onípele 14 tí ó yí RC ká, èyí tí a dá ìṣètò náà dúró, nígbà tí ìṣètò náà tí kò ní amuaradagba-W jẹ́ ìṣètò RC pátápátá tí a yí RC ká. Ìṣètò LH1 onípele 16 tí a ti pa. Ìfiwéra àwọn ìṣètò wọ̀nyí fúnni ní òye nípa agbára quinone nínú ìṣètò RC-LH1, pẹ̀lú àwọn àyípadà ìṣètò tí a kò tí ì pinnu tẹ́lẹ̀ nígbà tí a bá so quinone pọ̀ ní ojú-ọ̀nà RC QB, àti ipò àwọn ibi ìsopọ̀ quinone auxiliary, èyí tí ó ń ran wọ́n lọ́wọ́ láti fi wọ́n sí RC. Ìṣètò àrà ọ̀tọ̀ ti amuaradagba W ń dènà pípa LH1 lupu, nípa bẹ́ẹ̀ ó ń ṣẹ̀dá ọ̀nà kan fún mímú kí ìyípadà quinone/quinolone yára sí i.
Agbára tí photosynthesis ń pèsè lè gbé gbogbo ẹ̀dá ayé ró, ó sì ní agbára ńlá fún ìmọ̀-ẹ̀rọ oòrùn. Bí ó tilẹ̀ ń gbé photosynthesis lárugẹ kárí ayé, àwọn bakitéríà phototrophic aláwọ̀ elése tún ń fi onírúurú agbára àti agbára ìṣẹ̀dá hàn. Wọ́n lè yẹra fún photosynthesis kí wọ́n sì dàgbà bí bakitéríà heterotrophic nínú òkùnkùn, tí wọ́n lè ṣàtúnṣe nitrogen àti carbon dioxide, tí wọ́n lè mú hydrogen jáde, tí wọ́n sì lè ba àwọn èròjà aromatic jẹ́ (1-3). Láti lè pèsè agbára fún àwọn ìlànà wọ̀nyí, ìmọ́lẹ̀ gbọ́dọ̀ yí padà kíákíá sí agbára kẹ́míkà. Ìlànà yìí bẹ̀rẹ̀ nígbà tí eka eriali tí ń mú ìmọ́lẹ̀ bá fa ìmọ́lẹ̀, tí ó sì gbé agbára tí ó wà nínú rẹ̀ lọ sí ibi ìṣe (RC), nípa bẹ́ẹ̀ ó bẹ̀rẹ̀ sí í pínyà agbára (4-7). Ẹ̀yà ìpìlẹ̀ photosynthesis nínú bakitéríà phototrophic aláwọ̀ elése ni a ṣe láti oríṣi RC 2, tí a yí i ká pẹ̀lú complex 1 (LH1), tí ó ń ṣe complex RC-LH1 core complex. LH1 ni a dá nípasẹ̀ onírúurú αβ heterodimers tí ó ní ìlà, èyí tí ọ̀kọ̀ọ̀kan wọn so mọ́ chlorophyll bacterial (BChl) méjì àti carotenoids kan tàbí méjì (8-12). Eriali LH1 ti o rọrun julọ ni awọn heterodimers αβ 16 tabi 17 ti o yi RC (9-13) ka ni lupu ti a ti pa, ṣugbọn ninu awọn eka pataki miiran, awọn peptides transmembrane n da idaduro ilosiwaju ti LH1 ti o yi i ka, nitorinaa n ṣe igbega itankale quinol/quinone laarin RC ati cytochrome bc1 complex (11, 13-15). Ohun ọgbin phototrophic eleyi ti Rhodopseudomonas (Rps.) jẹ ẹya ara ẹrọ awoṣe ti o le loye agbara ati gbigbe elekitironi ti o ṣe atilẹyin fun photosynthesis. Eto kristali akọkọ ti Rps. Apẹẹrẹ ti eka palustris RC-LH1 ni RC, ti o yi nipasẹ awọn loopu heterodimeric LH1 15, eyiti amuaradagba aimọ kan ti a pe ni “Protein W” (14) da duro. Lẹhinna a ṣe idanimọ Protein-W bi RPA4402, eyiti o jẹ amuaradagba 10.5kDa ti a ko ṣe afihan pẹlu awọn helices transmembrane mẹta ti a sọ asọtẹlẹ (TMH) (16). A dámọ̀ràn láti yí orúkọ ìpìlẹ̀ rpa4402 padà sí pufW láti bá àwọn ìpìlẹ̀ rpa4402 tí ó ń yí èròjà protein W padà sí pufW mu. Ó yani lẹ́nu pé protein-W wà ní nǹkan bí 10% ti RC-LH1, èyí tí ó fi hàn pé Rps. palustris ń ṣe àwọn ìpìlẹ̀ RC-LH1 méjì tí ó yàtọ̀ síra. Níbí, a ń ròyìn àwọn ìpìlẹ̀ cryo-EM (cryo-EM) tí ó ní ìpìlẹ̀ gíga ti àwọn ìpìlẹ̀ méjì, ọ̀kan pẹ̀lú protein W àti 14 αβ heterodimers, èkejì láìsí protein W àti 16 Heterodimer LH1 loop tí a ti pa. Ìpìlẹ̀ wa dúró fún ìyípadà ìgbésẹ̀ nínú òye ti ìpìlẹ̀ RC-LH1 ti Rps. palustris, nítorí a ti ṣe àgbéyẹ̀wò iye ènìyàn tí ó jọra ti onírúurú kọ̀ọ̀kan, a sì ní ìpinnu tó tó láti fi peptide àti àwọn pigments tí a so pọ̀ mọ́ra àti àwọn lipids àti quinones tí ó jọra hàn kedere. Àfiwé àwọn ìṣètò wọ̀nyí fihàn pé àwọn protein TMH mẹ́ta tí a kò rí ní ìṣètò RC-LH1 mìíràn títí di ìsinsìnyí ń mú ikanni quinone jáde láti mú kí ìyípadà quinone/quinolone yára sí i. A ti ṣàwárí ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ibi ìsopọ̀ lipid àti quinone tí a ti tọ́jú, a sì ti ṣàfihàn ìyípadà ìṣètò tuntun lẹ́yìn ìdàpọ̀ quinone àti RC, èyí tí ó lè yẹ fún photosystem II (PSII) RC ti àwọn ohun alààyè phototrophic tí a ti yọ́ oxygenated. Àwọn àwárí wa fúnni ní òye tuntun nípa ìsopọ̀ quinone/quinolone àti ìyípadà nínú ìṣètò RC-LH1 ti àwọn bakitéríà phototrophic aláwọ̀ elése.
Láti lè ṣe ìwádìí kíkún lórí àwọn àkópọ̀ méjì tí a rí nínú Rps. palustris, a ya RC-LH1 kọ̀ọ̀kan sọ́tọ̀ nípasẹ̀ àwọn ọ̀nà biochemical. A yọ àkópọ̀ protein W tí kò ní protein (tí a ń pè ní ΔpufW lẹ́yìn èyí) kúrò nínú àkópọ̀ protein tí kò ní pufW (16), àti pé àkópọ̀ RC-LH1 kan ṣoṣo ni a lè ṣe. Àkópọ̀ protein W tí ó ní protein ni a ń ṣe nípasẹ̀ àkópọ̀ kan. A ń ṣe àtúnṣe protein W ti irú yìí pẹ̀lú àmì His 10x ní C-terminus rẹ̀, kí a lè so àkópọ̀ protein W tí ó ní protein pọ̀ mọ́ ọ̀pọ̀lọpọ̀ protein W tí kò ní protein nípa ṣíṣe ìdènà irin. A ya àkópọ̀ náà sọ́tọ̀ dáadáa (16) Affinity Chromatography (IMAC).
Gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn ní Àwòrán 1, àwọn àpapọ̀ méjèèjì ní RC kékeré mẹ́ta (RC-L, RC-M àti RC-H) tí a fi eriali LH1 yíká. Ìṣètò 2.80-A ti àpapọ̀ tí kò ní amuaradagba-W fi àwọn heterodimers αβ 16 hàn, tí wọ́n ń ṣe ìlù LH1 tí ó yí RC ká pátápátá, tí a ń pè ní RC-LH116 complex lẹ́yìn náà. Ìṣètò 2.65Å ti àpapọ̀ tí ó ní amuaradagba-W ní LH1 14-heterodimer tí protein-W dá dúró, tí a ń pè ní RC-LH114-W lẹ́yìn náà.
(A àti B) Àfihàn ojú ilẹ̀ ti àdàpọ̀ náà. (C àti D) Àwọn àwọ̀ tí a so pọ̀ tí a fi ọ̀pá dì. (E àti F) Àwọn àdàpọ̀ tí a ṣàkíyèsí láti ojú cytoplasmic ní àwọn peptides àti àwọn subunits LH1 tí a fihàn nínú àwọn àwòrán oníṣẹ́ ọnà, a sì nọ́mbà wọn ní ọ̀nà aago láti inú àlàfo protein-W [tí ó bá Rba nọ́mbà. sphaeroides complex (13)] mu. Fún LH1-α, àwọ̀ subunit protein jẹ́ ofeefee; fún LH1-β, àwọ̀ subunit protein jẹ́ búlúù; fún protein-W, amuaradagba jẹ́ pupa; fún RC-H, ó jẹ́ cyan; fún RC-L, ó jẹ́ Orange; fún RC-M, magenta. Àwọn cofactors ni a ṣojú fún nípasẹ̀ rods, ewéko dúró fún BChl àti BPh a molecules, elése àlùkò dúró fún carotenoids, àti yellow dúró fún àwọn molecules UQ10. (G àti H) Ìwòye tí ó ga jùlọ ti àlàfo protein-W ní agbègbè tí ó dọ́gba ti àdàpọ̀ RC-LH114-W (G) àti RC-LH116 complex (H). A fi àwọn ohun tí ó ń sopọ̀ mọ́ ara wọn hàn ní ìrísí ààyè, a sì fi quinone onílà tí a ti kùn ní àwọ̀ búlúù hàn. A fi ìlà aláwọ̀ búlúù tí a ti kùn ní àwọ̀ búlúù hàn ní (G), a sì fi ìlà aláwọ̀ dúdú tí a ti kùn ní àwọ̀ dúdú hàn ní (H) ní àwọ̀ dúdú tí a ti kùn ní àwọ̀ dúdú.
Àwòrán 1 (A àti B) fi RC hàn tí a fi àwọn heterodimers LH1αβ tí ó ṣí sílẹ̀ tàbí tí ó ti sé yíká, èyí tí ọ̀kọ̀ọ̀kan wọn so BChl méjì àti carotenoid kan pọ̀ (Àwòrán 1, C àti D). Àwọn ìwádìí tí ó ti kọjá ti fi hàn pé Rps ni ìṣọ̀kan LH1. Nínú ipa ọ̀nà bíosynthetic ti spirulina xanthin, àwọn irú wọ̀nyí ní àwọn èròjà carotenoids tí ó parapọ̀ (17). Síbẹ̀síbẹ̀, spiropyrroxanthin ni carotenoid tí ó gbajúmọ̀ jùlọ àti pé ìwọ̀n rẹ̀ tẹ́lọ́rùn. Nítorí náà, a yàn láti ṣe àpẹẹrẹ spiroxanthin ní gbogbo àwọn ibi ìsopọ̀ LH1. Àwọn polypeptide alpha àti beta jẹ́ TMH kan ṣoṣo pẹ̀lú àwọn agbègbè ìta membrane kúkúrú (Àwòrán 1, A, B, E, àti F). Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a kò rí ìwọ̀n àwọn ìyókù 17 ní C-terminus, a ya alpha polypeptide kúrò láti Met1 sí Ala46 nínú àwọn àpapọ̀ méjèèjì. A dín β polypeptide kù láti Gly4 sí Tyr52 ní RC-LH116, àti láti Ser5 sí Tyr52 ní RC-LH114-W. A kò rí ìwọ̀n ìpele N-terminal 3 tàbí 4 tàbí 13 C-terminal residents (Àwòrán S1). Ìwádìí Mass spectrometry ti adalu RC-LH1 complex tí a pèsè láti inú irú wild-type strain fihàn pé agbègbè tí ó pàdánù jẹ́ àbájáde ìyapa heterologous ti àwọn peptides wọ̀nyí (Àwòrán S1 àti S2). A tún rí ìṣẹ̀dá N-terminal ti α-Met1 (f). Ìwádìí náà fihàn pé α-peptide ní àwọn residents fMet1 sí Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, àti pé β-peptide ní àwọn residents Ser2 sí Ala53, èyí tí ó bá àwòrán density EM tí ó wà ní ìwọ̀n otútù díẹ̀ mu.
Ìṣọ̀kan α-His29 àti β-His36 mú kí BChls dojú kọ ojú; αβ heterodimer kọ̀ọ̀kan máa ń kórajọ pẹ̀lú àwọn aládùúgbò rẹ̀ láti ṣẹ̀dá lupu ṣíṣí (RC-LH114-W) tàbí lupu dídí (RC-LH116) ní àyíká RC. Àkójọpọ̀ pigment tí a so pọ̀ mọ́ exciton (Àwòrán 1, C àti D). Ní ​​ìfiwéra pẹ̀lú band 877 nm ti RC-LH114-W, ìyípadà pupa absorption 880 nm ti RC-LH116 jẹ́ 3 nm (Àwòrán 2A). Síbẹ̀síbẹ̀, ìpele dichroism yíká fẹ́rẹ̀ jọra (Àwòrán 2B), èyí tí ó fihàn pé bó tilẹ̀ jẹ́ pé ìyàtọ̀ kedere wà láàrín àwọn lupu ṣíṣí àti àwọn lupu dídí, àyíká agbègbè ti BChls jọra gan-an. Ìyípadà red absorption lè jẹ́ àbájáde ìṣípo ooru tí ó dínkù àti ìdúróṣinṣin tí ó pọ̀ sí i lórí lupu dídí (18, 19), ìyípadà nínú ìsopọ̀ pigment tí lupu dídí fa (20, 21), tàbí àpapọ̀ àwọn ipa méjì wọ̀nyí (11).
(A) Ìwọ̀n ìfàmọ́ra Ultraviolet/tí a lè rí/tó súnmọ́-infrared, àwọn òkè tí a fi àmì sí pẹ̀lú àwọn àwọ̀ tí ó báramu wọn tí a sì sọ di òṣùwọ̀n BPh ní 775 nm. (B) Ìwọ̀n ìfàmọ́ra dichroism yíká tí a sọ di òṣùwọ̀n sí BChl ní 805 nm. (C àti D) Ìwọ̀n ìfàmọ́ra ΔA tí a yàn láti inú ìwọ̀n ìfàmọ́ra tí a yanjú àkókò ti ìṣọ̀kan RC-LH114-W (C) àti ìṣọ̀kan RC-LH116 (D). Fún ìfiwéra tí ó dára jù, gbogbo ìṣọ̀kan ni a ṣe déédé sí ∆A ti −A ní 0.2 ps. (E) Ìwọ̀n ìfàmọ́ra cytochrome c2 lẹ́yìn ìtànṣán ní iwájú onírúurú ìfọ́mọ́ra ti UQ2 (wo Àwòrán S8 fún ìwádìí aise). (F) Nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a gbìn lábẹ́ ìmọ́lẹ̀ kékeré, àárín tàbí gíga (10, 30 tàbí 300μMm-2 s-1, lẹ́sẹẹsẹ), àwọn ìpín protein W àti RC-L nínú ìṣọ̀kan tí a sọ di mímọ́ àti ìpíndọ́gba membrane tí a yà sọ́tọ̀. Pinnu ipele amuaradagba nipasẹ electrophoresis jeli SDS-polyacrylamide ati immunoassay (wo Aworan S9 fun data aise). Pinnu ipin ti o ni ibatan si eka RC-LH114-W ti a ti sọ di mimọ. Ipin stoichiometric ti RC-L si amuaradagba-W ti eka naa jẹ 1:1.
Àwọn BChls ní ipò 1 nínú ìyípo αβ14 tí ó ti bàjẹ́ ti RC-LH114-W (Àwòrán 1, A, C, àti E) sún mọ́ olùfúnni àkọ́kọ́ RC (P) nípa 6.8Å ju àwọn BChls tí ó dọ́gba ní RC-LH116 (Àwòrán 1, B, D, àti F, àti Àwòrán S3); síbẹ̀síbẹ̀, àwọn ìfàsẹ́yìn ìgbàsókè ti àwọn àpapọ̀ méjèèjì fihàn pé fún RC-LH114-W àti RC-LH116, àwọn ìdúróṣinṣin àkókò ìgbésókè agbára ìfúnni láti LH1 sí RC jẹ́ 40 ±4 àti 44±3 ps (Àwòrán 2). , C àti D, Àwòrán S4 àti Táblì S2). Kò sí ìyàtọ̀ pàtàkì nínú ìgbésẹ́ itanna láàrín RC (Àwòrán S5 àti àfikún ọ̀rọ̀ tí ó jọra). A fura pé ìbáramu tímọ́tímọ́ ti àkókò ìgbésẹ́ agbára láàrín LH1 àti RC-P jẹ́ nítorí ìjìnnà, igun àti agbára tí ó jọra ti ọ̀pọ̀lọpọ̀ BChl nínú àwọn ìyípo LH1 méjì. Ó dà bíi pé wíwá ọ̀nà agbára LH1 láti dé ibi tí ó kéré jùlọ kò yára ju ìgbésẹ̀ agbára tààrà láti àwọn ibi tí kò dára jùlọ lọ sí RC. LH1 lupu tí ó ṣí sílẹ̀ nínú RC-LH114-W tún lè fara gba ìṣípo ooru tí kò ṣe pàtàkì lábẹ́ àwọn ipò òtútù kékeré fún ìṣàyẹ̀wò ìṣètò, àti pé ìrísí òrùka αβ14 tí ó gùn sí i wà ní ìwọ̀n òtútù yàrá láti ìjìnnà àwọ̀ ti βBChls ní ipò RC 1.
Àkójọpọ̀ RC-LH116 ní 32 BChls àti carotenoids 16, àti pé ìṣètò gbogbo rẹ̀ jọra gẹ́gẹ́ bí èyí tí a rí láti inú Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) àti ewéko aláwọ̀ ewé (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Lẹ́yìn tí a ti ṣe ìtòlẹ́sẹẹsẹ, àwọn ìyàtọ̀ kékeré nìkan ni a rí ní ipò àwọn heterodimers αβ, pàápàá jùlọ 1-5, 15, àti 16 (Àwòrán S6). Wíwà protein-W ní ipa pàtàkì lórí ìṣètò LH1. Àwọn TMH mẹ́ta rẹ̀ ni a so pọ̀ nípasẹ̀ àwọn ìlọ́po kúkúrú, pẹ̀lú N-terminal ní ẹ̀gbẹ́ lumen ti complex àti C-terminal ní ẹ̀gbẹ́ cytoplasmic (Àwòrán 1A àti 3, A sí D). Prótéènì-W jẹ́ hydrophobic ní pàtàkì (Àwòrán 3B), àti pé TMH2 àti TMH3 ń bá LH1αβ-14 ṣiṣẹ́ pọ̀ láti ṣẹ̀dá ojú àwọ̀ transmembrane kan (Àwòrán 3, B àti E sí G). Ìsopọ̀ náà jẹ́ ti àwọn ìyókù Phe, Leu àti Val ní agbègbè transmembrane. Àwọn ìyókù wọ̀nyí ni a kó pọ̀ pẹ̀lú àwọn amino acids hydrophobic àti àwọn pigments αβ-14. Àwọn ìyókù polar kan tún ń ṣe àfikún sí ìbáṣepọ̀ náà, títí kan ìsopọ̀ hydrogen láàárín W-Thr68 àti β-Trp42 lórí ojú àwọ̀ tí ó díjú (Àwòrán 3, F àti G). Lórí ojú cytoplasm, Gln34 wà ní ẹ̀gbẹ́ ẹgbẹ́ keto ti carotenoids αβ-14. Ní àfikún, a yanjú molecule n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM), a sì na ìrù hydrophobic rẹ̀ sí ìbáṣepọ̀ láàrín protein-W àti αβ-14, àti pé ìrù lipid náà lè wà nínú ara. A tún kíyèsí pé àwọn agbègbè ìpinnu C-terminal ti protein W àti RCH súnmọ́ra gan-an, ṣùgbọ́n kìí ṣe láàárín àyè ṣíṣe àwọn ìbáṣepọ̀ pàtó (Àwòrán 1, A àti E). Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn ìbáṣepọ̀ lè wà nínú àwọn amino acids C-terminal tí a kò tí ì yanjú nínú àwọn protein méjì wọ̀nyí, èyí tí ó lè pèsè ìlànà fún gbígba protein-W nígbà tí a bá ń kó RC-LH114-W complex jọ.
(A) Protein-W, tí ó dojúkọ ìsopọ̀ pẹ̀lú LH1αβ14 ní ìrísí àwòrán onífọ́, ní ẹ̀wọ̀n ẹ̀gbẹ́ tí ó rí bí ọ̀pá (pupa), tí a fihàn ní apá kan ti àwòrán agbára electrostatic (ilẹ̀ grẹ́y tí ó hàn gbangba pẹ̀lú ìpele contour ti 0.13). (B) Protein-W tí ojú àwọ̀ hydrophobic dúró fún. Àwọn agbègbè polar àti chargeed ni a fihàn ní cyan, àwọn agbègbè hydrophobic ni a fihàn ní funfun, àti àwọn agbègbè hydrophobic tí ó lágbára ni a fihàn ní osàn. (C àti D) Protein-W dúró fún nínú àwòrán onífọ́, ìtọ́sọ́nà rẹ̀ jẹ́ kan náà gẹ́gẹ́ bí ó ti wà nínú (A) (C), a sì yí i padà pẹ̀lú 180° (D). Gẹ́gẹ́ bí ipò tí ó wà nínú ìtẹ̀léra náà, àwọn èérún tí a lè yà sọ́tọ̀ gba àwòrán àwọ̀ òṣùmàrè, níbi tí N-terminal jẹ́ búlúù àti C-terminal jẹ́ pupa. (E) Protein-W ní ìrísí kan náà gẹ́gẹ́ bí ó ti wà nínú (A), àti àwọn èérún ní ìsopọ̀ protein-W:LH1 ni a ṣojú fún pẹ̀lú àwọn ọ̀pá tí a so mọ́. (F) A yí Prótéènì-W ní 90° ní ìbámu pẹ̀lú (E) àti LH1αβ14 nínú ìṣàfihàn àwòrán, àti ní ìbámu pẹ̀lú àwọn ìṣẹ́kù ìsopọ̀ nínú ìṣàfihàn ọ̀pá. A fi àmì sí àwọn ìṣẹ́kù ìsopọ̀ láti inú beta polypeptide. A fi àmì sí cofactor gẹ́gẹ́ bí ọ̀pá tí ó bá àwọ̀ Àwòrán 1 mu, a fi β-DDM tí ó ti bàjẹ́ hàn ní àwọ̀ ewé, a sì fi atẹ́gùn hàn ní àwọ̀ pupa. (G) Ìwò tí ó wà nínú (F) yí ní 180°, pẹ̀lú àwọn ìṣẹ́kù ìsopọ̀ tí ó hàn gbangba ti alpha polypeptide tí a fi àmì sí.
Púrọ́tínì-W rọ́pò αβ heterodimer (ìpín kẹẹ̀ẹ́dógún nínú Àwòrán 1F), nípa bẹ́ẹ̀ ó ń dènà pípa lupu àti títẹ̀ àwọn αβ heterodimer mẹ́ta àkọ́kọ́. A ṣàkíyèsí pé igun títẹ̀ tó ga jùlọ ti heterodimer αβ-1 àkọ́kọ́ ní ìbámu pẹ̀lú fíìmù déédé jẹ́ 25° sí 29° (Àwòrán 1, A àti E), èyí tí a ṣẹ̀dá nípasẹ̀ ìtẹ̀sí 2° sí 8° ti αβ-1 nínú RC A onípele-LH116 (Àwòrán 1, B àti F). Àwọn heterodimer kejì àti kẹta tẹ̀ sí 12° sí 22° àti 5° sí 10°, lẹ́sẹẹsẹ. Nítorí ìdíwọ́ steric ti RC, títẹ̀ αβ-1 kò ní méjì kejì ti αβ (èyí tí ó bá αβ kẹrìndínlógún mu nínú Àwòrán 1F), nípa bẹ́ẹ̀ ó ń ṣe àlàfo tí ó hàn gbangba nínú òrùka LH1 (Àwòrán 1, A àti E). Nítorí àìsí àwọn heterodimers αβ méjì, pẹ̀lú pípadánù BChl mẹ́rin àti carotenoids méjì, kò sí èyíkéyìí nínú àwọn carotenoids tí ó so mọ́ subunit αβ-1 tí ó yípo, èyí tí ó yọrí sí òrùka LH114-W tí ó ní carotenoids 13. Àwọn onímọ̀ nípa ìṣàyẹ̀wò ìpinnu agbègbè ti àwọn complexes méjì nínú àwọn agbègbè αβ1 sí 7 kéré sí ti àwọn ti ìyókù LH1 lupu, èyí tí ó lè ṣe àfihàn plasticity tí ó wà nínú subunit LH1 tí ó wà ní ẹ̀gbẹ́ ibi RC QB (Àwòrán 4).
Àwọn àwòrán RC-LH114-W (A àti B) àti RC-LH116 (C àti D) ni a fi hàn láti ojú ìwòye òkè/ìwòye ẹ̀gbẹ́ kan náà (A àti B) (A àti C) àti ojú ihò ti Àwòrán 1. (B àti D). Àwọn kọ́kọ́rọ́ aláwọ̀ náà ni a fi hàn ní apá ọ̀tún.
Àkójọpọ̀ mojuto mìíràn tí ó ní ìpíndọ́gba stoichiometric ti 1:14 ni Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Síbẹ̀síbẹ̀, protein W àti PufX kò ní ìbáramu tí ó hàn gbangba, wọ́n sì ní ipa pàtàkì lórí àwọn ìṣètò LH1 wọn. PufX jẹ́ TMH kan ṣoṣo pẹ̀lú agbègbè cytoplasmic N-terminal tí ó ń bá ẹ̀gbẹ́ cytoplasmic ti subunit RC-H (13) lò ní ipò tí ó bá Rps. palustris LH116αβ-16 mu. PufX ṣẹ̀dá ikanni kan fún ìyípadà quinone/quinolone láàrín RC-LH1 àti cytochrome bcl complex ó sì wà ní gbogbo Rba. sphaeroides core complex (13). Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ìsopọ̀ monomer-monomer wà ní Rba. Àwọn sphaeroides RC-LH1-PufX dimer wà ní ipò ìsopọ̀ protein W nínú RC-LH114-W, àti àlà tí PufX àti protein-W fà wà ní ipò tó dọ́gba (Àwòrán S7A). Ààlà nínú RC-LH114-W tún bá ikanni quinone onípele (8) ti Pseudomonas rosea LH1 mu, èyí tí àwọn peptide tí kò ní í ṣe pẹ̀lú protein W tàbí PufX ṣe (Àwòrán S7B). Ní ​​àfikún, ikanni quinone nínú Blc. LH1 aláwọ̀ ewé tí a ṣe nípa yíyọkúrò subunit γ kan (7) wà ní ipò kan náà (Àwòrán S7C). Bó tilẹ̀ jẹ́ pé onírúurú protein ló wà níbẹ̀, ìfarahàn àwọn ikanni quinone/quinolol wọ̀nyí ní ipò kan náà nínú RC-LH1 complex dàbí àpẹẹrẹ ìyípadà convergent, èyí tó fihàn pé àlà tí protein W dá lè ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí ikanni quinone.
Ààlà tó wà nínú LH114-W lupu náà gba ààyè láti ṣẹ̀dá agbègbè membrane tó ń tẹ̀síwájú láàárín ààyè inú RC-LH114-W complex àti bulk membrane (Àwòrán 1G), dípò kí ó so àwọn agbègbè méjèèjì pọ̀ nípasẹ̀ ihò protein gẹ́gẹ́ bí ó ti wà nínú àwọn protein. Complex RC-LH116 jọ complex Tch. abẹ́rẹ́ tó dàbí abẹ́rẹ́ (22) (Àwòrán 1H). Nítorí pé ìtànkálẹ̀ quinone nípasẹ̀ membrane yára ju ìtànkálẹ̀ lọ nípasẹ̀ ikanni protein tóóró, ìlù LH114-W tó ṣí sílẹ̀ lè gba ìyípadà RC tó yára ju ìlù LH116 tó ti pa lọ, àti pé ìtànkálẹ̀ quinone sínú RC lè ní ìdíwọ́ díẹ̀. Láti dán wò bóyá protein W ní ipa lórí ìyípadà quinones nípasẹ̀ RC, a ṣe ìdánwò oxidation cytochrome lórí ìṣọ̀kan ubiquinone 2 (UQ2) kan (àpẹẹrẹ UQ10 àdánidá pẹ̀lú ìrù isoprene kúkúrú) (Àwòrán 2E). Bó tilẹ̀ jẹ́ pé wíwà quinone chelated ń dí ìpinnu pípéye ti Michaelis constant tí ó hàn gbangba lọ́wọ́ (RC-LH114-W àti RC-LH116 yẹ fún 0.2±0.1μM àti 0.5±0.2μM, lẹ́sẹẹsẹ), ìwọ̀n tí ó pọ̀ jùlọ ti RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) jẹ́ 28±5% tí ó tóbi ju RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Ní àkọ́kọ́, a ṣírò pé protein-W wà nínú nǹkan bí 10% ti àpapọ̀ pàtàkì (16); níbí, ìwọ̀n gbígbé àwọn sẹ́ẹ̀lì ìdàgbàsókè ìmọ́lẹ̀ kékeré, ìmọ́lẹ̀ àárín, àti ìmọ́lẹ̀ gíga jẹ́ 15±0.6%, 11±1% àti 0.9±0.5, ní ìtẹ̀léra % (Àwòrán 2F). Ìfiwéra iye owó ti mass spectrometry fihàn pé àfikún àmì histidine kò dín iye protein-W kù ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn irú ẹranko (P = 0.59), nítorí náà àwọn ìwọ̀n wọ̀nyí kì í ṣe ohun àtọwọ́dá ti protein-W tí a yípadà (Àwòrán S10). Síbẹ̀síbẹ̀, ìwọ̀n protein-W tí ó kéré yìí nínú àpapọ̀ RC-LH1 lè jẹ́ kí àwọn RC kan yípadà ní ìwọ̀n ìyára, nípa bẹ́ẹ̀ ó dín ìyípadà quinone/quinolone tí ó lọ́ra kù nínú àpapọ̀ RC-LH116 kù. A ṣàkíyèsí pé ìwọ̀n gbígbé ìmọ́lẹ̀ gíga kò bá àwọn ìwádìí transcriptomics tí ó ṣẹ̀ṣẹ̀ wáyé mu, èyí tí ó fihàn pé ìfarahàn jínì pufW ń pọ̀ sí i lábẹ́ ìmọ́lẹ̀ líle (Àwòrán S11) (23). Iyatọ laarin kikọ pufW ati idapọ amuaradagba-W sinu akojọpọ RC-LH1 jẹ ohun ti o daamu ati pe o le ṣe afihan ilana ti o ni idiju ti amuaradagba naa.
Nínú RC-LH114-W, a pín àwọn molecule cardiolipin 6 (CDL), phosphatidylcholine 7 (POPC), phosphatidylglycerol 1 (POPG) àti 29 β-DDM sí àwọn molecule 6 nínú rẹ̀, a sì ṣe àwòkọ́ṣe wọn nínú rẹ̀. CDL 6, POPC 24, POPG 2 àti βDDM 12. RC-LH116 (Àwòrán 5, A àti B). Nínú àwọn ẹ̀ka méjèèjì yìí, CDL fẹ́rẹ̀ẹ́ wà ní apá cytoplasmic ti ẹ̀ka náà, nígbà tí POPC, POPG àti β-DDM wà ní apá luminal jùlọ. A ya àwọn molecule lipid àti detergent méjì sọ́tọ̀ ní agbègbè αβ-1 sí αβ-6 ti ẹ̀ka RC-LH114-W (Àwòrán 5A), a sì ya márùn-ún sọ́tọ̀ ní agbègbè RC-LH116 tó dọ́gba (Àwòrán 5B). A rí àwọn ọ̀rá púpọ̀ sí i ní apá kejì ti àkójọpọ̀ náà, pàápàá jùlọ CDL, tí a kó jọ láàárín RC àti αβ-7 sí αβ-13 (Àwòrán 5, A àti B). Àwọn ọ̀rá àti ọrá mìíràn tí a ti yanjú ní ìṣètò wà ní ìta òrùka LH1, àti àwọn ẹ̀wọ̀n acyl tí a ti yanjú dáadáa nà láàrín àwọn ìpín LH1, tí a yàn gẹ́gẹ́ bí β-DDM nínú RC-LH114-W, tí a sì túmọ̀ sí β-DDM nínú àdàpọ̀ RC A ti β-DDM àti POPC-LH116. Àwọn ipò tí ó jọra ti àwọn ọ̀rá àti ọrá nínú ìṣètò wa fihàn pé wọ́n jẹ́ àwọn ibi ìsopọ̀ tí ó bá ti ara mu (Àwòrán S12A). Àwọn ipò àwọn mọ́lẹ́kúlù tí ó jọra ní Tch náà ní ìṣọ̀kan tí ó dára. Onírẹ̀lẹ̀ àti Trv. Àwọn ìpele 970 RC-LH1 (Àwòrán S12, B sí E) (9, 12) àti àwọn ìyókù ìsopọ̀ hydrogen ti ẹgbẹ́ orí lipid fi ìpamọ́ tó dára hàn nínú ìtòlẹ́sẹẹsẹ ìtẹ̀léra (Àwòrán S13), èyí tó fi hàn pé àwọn ibi wọ̀nyí lè wà ní ìpamọ́ nínú àkójọ RC-LH1.
(A àti B) Àwọn peptide RC-LH114-W (A) àti RC-LH116 (B) ni a fi àwòrán àwòrán ṣe àfihàn, àwọn pigments sì ni a fi ọ̀pá ṣe àfihàn, nípa lílo àwọ̀ tí ó wà nínú Àwòrán 1. A fi lipids hàn ní pupa, a sì fi àwọn ohun ìfọmọ́ra hàn ní grẹ́y. UQ tí a so mọ́ àwọn ibi RC QA àti QB jẹ́ yẹ́lò, nígbà tí UQ tí a yà sọ́tọ̀ jẹ́ búlúù. (C àti D) Àwọn ìwò kan náà gẹ́gẹ́ bí (A) àti (B), pẹ̀lú àwọn lipid tí a yọ kúrò. (E sí G) Ìwò tí a gbòòrò ti Q1(E), Q2(F) àti Q3(G) láti RC-LH116, pẹ̀lú àwọn ẹ̀wọ̀n ẹ̀gbẹ́ tí ó ní ipa lórí ara wọn. Àwọn ìdè hydrogen ni a fihàn gẹ́gẹ́ bí àwọn ìlà dúdú tí a fi àmì sí.
Nínú RC-LH116, àwọn RC QA àti QB UQ, tí wọ́n ń kópa nínú ìyípadà elekitironi nínú ìlànà ìyàsọ́tọ̀ agbára, ni a ti yọ́ kúrò nínú àwọn ibi ìsopọ̀ wọn. Síbẹ̀síbẹ̀, nínú RC-LH114-W, a kò tíì yanjú quinone QB, a ó sì jíròrò rẹ̀ ní kíkún ní ìsàlẹ̀. Ní àfikún sí QA àti QB quinones, àwọn molecule UQ méjì tí a ti yọ́ (tí ó wà láàrín àwọn òrùka RC àti LH1) ni a pín sí ìṣètò RC-LH114-W gẹ́gẹ́ bí àwọn ẹgbẹ́ orí wọn tí a ti yanjú dáadáa (tí ó wà ní Q1 àti Q2, ní ìtẹ̀léra). Àwòrán 5C). A yan àwọn ìpín isoprene méjì sí Q1, àti pé máàpù density náà yanjú àwọn ìrù isoprene 10 pípé ti Q2. Nínú ìṣètò RC-LH116, a yanjú àwọn molecule UQ10 mẹ́ta tí a ti yọ́ (Q1 sí Q3, Àwòrán 5D), gbogbo àwọn molecule sì ní ìwọ̀n tí ó ṣe kedere jákèjádò ìrù náà (Àwòrán 5, D sí G). Nínú àwọn ìṣètò méjèèjì, ipò àwọn ẹgbẹ́ orí quinone ti Q1 àti Q2 ní ìṣọ̀kan tó dára gan-an (Àwòrán S12F), wọ́n sì ń bá RC ṣeré nìkan. Q1 wà ní ẹnu ọ̀nà àlàfo W ti RC-LH114-W (Àwòrán 1G àti 5, C, D àti E), àti Q2 wà nítòsí ibi ìsopọ̀ QB (Àwòrán 5, C, D) àti F). Àwọn ìyókù L-Trp143 àti L-Trp269 tí a pa mọ́ súnmọ́ Q1 àti Q2 gan-an, wọ́n sì ń pèsè àwọn ìbáṣepọ̀ π tí ó ṣeé ṣe (Àwòrán 5, E àti F, àti Àwòrán S12). L-Gln88, 3.0 Å láti inú atẹ́gùn jíjìn ti Q1, ń pèsè ìsopọ̀ hydrogen tó lágbára (Àwòrán 5E); ìyókù yìí wà ní ìpamọ́ nínú gbogbo RC àyàfi ìbáṣepọ̀ tó jìnnà jùlọ (Àwòrán S13). A fi ìṣọ́ra rọ́pò L-Ser91 fún Thr nínú ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn RC mìíràn (Àwòrán S13), ó jẹ́ 3.8 Angstroms láti inú methyl oxygen ti Q1, ó sì lè pèsè àwọn ìdè hydrogen tí kò lágbára (Àwòrán 5E). Q3 kò dàbí ẹni pé ó ní ìbáṣepọ̀ pàtó kan, ṣùgbọ́n ó wà ní agbègbè hydrophobic láàárín subunit RC-M àti subunit LH1-α 5 sí 6 (Àwòrán 5, D àti G). A ti yanjú Q1, Q2 àti Q3 tàbí àwọn quinone chelated tí ó wà nítòsí nínú Tch. Gentle, Trv. Strain 970 àti Blc. Ìṣètò iris (9, 10, 12) tọ́ka sí ibi ìsopọ̀ quinone auxiliary tí a pa mọ́ nínú complex RC-LH1 (Àwòrán S12G). Àwọn UQ márùn-ún tí a ti gé kúrò nínú RC-LH116 bá 5.8±0.7 ti gbogbo àkópọ̀ tí a pinnu nípasẹ̀ high performance liquid chromatography (HPLC), nígbà tí àwọn UQ mẹ́ta tí a ti gé kúrò nínú RC-LH114-W kéré sí. Iye tí a wọ̀n ti 6.2±0.3 (Àwòrán S14) fihàn pé àwọn molecule UQ tí a kò tí ì yanjú wà nínú ìṣètò náà.
Àwọn polypeptide L àti M tí ó jẹ́ pseudo-symmetric kọ̀ọ̀kan ní TMH márùn-ún, wọ́n sì para pọ̀ di heterodimer kan tí ó so BChl dimer kan pọ̀, àwọn monomer BChl méjì, àwọn monomer bacteriophage méjì (BPh), àti irin tí kìí ṣe Heme kan àti àwọn molecule UQ10 kan tàbí méjì. Nípasẹ̀ wíwà àwọn ìdè hydrogen lórí ẹgbẹ́ ketone tí ó wà ní ìpele àti ìkójọpọ̀ rẹ̀ tí a mọ̀ ní Rps, a fi àwọn carotenoids sínú M-subunit, èyí tí a pè ní cis-3,4-dehydroorhodopin. Àwọn irúgbìn (25). Agbára membrane òde ti RC-H ni a so mọ́ membrane náà nípasẹ̀ TMH kan ṣoṣo. Ìṣètò RC gbogbogbòò jọ RC subunit mẹ́ta ti àwọn irú tí ó jọra (bíi Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Àwọn macrocycles ti BChl àti BPh, egungun carotenoid àti irin tí kìí ṣe heme bò ara wọn mọ́ ara wọn láàárín ìwọ̀n ìpinnu ti àwọn ètò wọ̀nyí, gẹ́gẹ́ bí ẹgbẹ́ orí UQ10 ní ibi QA àti quinone QB ní RC-LH116 (Àwòrán S15).
Wíwà àwọn ilé RC méjì pẹ̀lú iye ìgbà tí wọ́n ń gbé ní QB fúnni ní àǹfààní tuntun láti ṣàyẹ̀wò àwọn àyípadà ìrísí tó bá ìsopọ̀ quinone QB mu. Nínú ilé RC-LH116, quinone QB wà ní ipò “tó súnmọ́” (26), ṣùgbọ́n ìyàsọ́tọ̀ RC-LH114-W kò ní quinone QB. Kò sí quinone QB nínú RC-LH114-W, èyí tó yani lẹ́nu nítorí pé ilé náà ń ṣiṣẹ́, ju ilé RC-LH116 pẹ̀lú quinone QB tó yanjú ní ìrísí lọ. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn òrùka LH1 méjì náà ń yí nǹkan bí quinone mẹ́fà padà, márùn-ún ni a ti yanjú ní ìrísí nínú òrùka RC-LH116 tó ti pa, nígbà tí mẹ́ta péré ni a ti lopin ní ìrísí nínú òrùka RC-LH114-W tó ṣí sílẹ̀. Ìṣòro ìrísí tó pọ̀ sí i yìí lè ṣe àfihàn ìyípadà kíákíá ti àwọn ibi RC-LH114-W QB, kíákíá quinone nínú ilé náà, àti ìṣeéṣe tó pọ̀ sí i láti kọjá LH1 lupu. A daba pe aini UQ ninu aaye RC QB ti RC-LH114-W le jẹ abajade ti eka ti o nira diẹ sii ati ti nṣiṣe lọwọ diẹ sii, ati pe aaye QB ti RC-LH114-W ti di didi lẹsẹkẹsẹ ni iyipada UQ Ipele kan pato (ẹnu ọna si aaye QB ti wa ni pipade) ṣe afihan iṣeto ti iṣẹ yii.
Láìsí QB, ìyípo L-Phe217 tí ó tẹ̀lé e sí ipò tí kò bá ìsopọ̀ UQ10 mu, nítorí pé yóò fa ìkọlù ààyè pẹ̀lú ẹ̀rọ isoprene àkọ́kọ́ ti ìrù (Àwòrán 6A). Ní ​​àfikún, àwọn ìyípadà ìrísí pàtàkì tí ó hàn gbangba hàn gbangba, pàápàá jùlọ helix de (helix kúkúrú nínú ìyípo láàárín TMH D àti E) níbi tí a ti yí L-Phe217 sí àpò ìsopọ̀ QB àti ìyípo L-Tyr223 (Àwòrán 6A) Láti fọ́ ìsopọ̀ hydrogen pẹ̀lú ìlànà M-Asp45 àti láti ti ẹnu ọ̀nà ibi ìsopọ̀ QB (Àwòrán 6B). Helix de yípo ní ìpìlẹ̀ rẹ̀, a yí Cα ti L-Ser209 padà pẹ̀lú 0.33Å, nígbà tí a yí L-Val221Cα padà nípasẹ̀ 3.52Å. Kò sí àwọn ìyípadà tí a lè rí nínú TMH D àti E, èyí tí ó ṣeé ṣe kí ó wà ní ipò méjì (Àwòrán 6A). Gẹ́gẹ́ bí a ti mọ̀, èyí ni ìṣètò àkọ́kọ́ nínú RC àdánidá tí ó ti ojú ibi QB náà. Ìfiwéra pẹ̀lú ìṣètò pípé (tí a so mọ́ QB) fihàn pé kí a tó dín quinone kù, a nílò ìyípadà ìrísí láti jẹ́ kí ó wọ inú quinone. L-Phe217 yípo láti ṣẹ̀dá ìbáṣepọ̀ π-stacking pẹ̀lú ẹgbẹ́ orí quinone, helix sì yípo síta, èyí tí ó fún egungun L-Gly222 àti ẹ̀wọ̀n ẹ̀gbẹ́ L-Tyr223 láàyè láti ṣẹ̀dá nẹ́tíwọ́ọ̀kì ìdè hydrogen pẹ̀lú ìṣètò ìdè hydrogen tí ó dúró ṣinṣin (Àwòrán 6, A àti C).
(A) Àwòrán àwòrán hologram (ẹ̀wọ̀n L, ẹ̀wọ̀n osàn/M, magenta) àti ìṣètò apo (grẹy), níbi tí a ti fi àwọn ohun tí ó wà nínú rẹ̀ hàn gẹ́gẹ́ bí ìṣàfihàn ọ̀pá. UQ10 ni a fi ọ̀pá ofeefee ṣe àfihàn. Ìlà àmì náà fi àwọn ìdè hydrogen tí a ṣe nínú gbogbo ìṣètò náà hàn. (B àti C) Àfihàn ojú apolipoprotein àti gbogbo ìṣètò òrùka, tí ó ń ṣàfihàn atẹ́gùn ẹ̀gbẹ́ ẹ̀wọ̀n L-Phe217 ní àwọ̀ búlúù àti L-Tyr223 ní pupa, lẹ́sẹẹsẹ. Ìlà L jẹ́ àwọ̀ ọsàn; àwọn ìlà M àti H kò ní àwọ̀. (D àti E) Apolipoprotein (D) àti gbogbo (E) àwọn ibi RC QB [àwọ̀ nípasẹ̀ (A) lẹ́sẹẹsẹ] àti Thermophilus thermophilus PSII (àwọ̀ ewé, búlúù pẹ̀lú quinone ike; PDB ID: 3WU2) Ṣàtúnṣe (58).
Láìròtẹ́lẹ̀, bó tilẹ̀ jẹ́ pé ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn RC tí kò ní QB tí kò ní LH1 wà, a kò tíì ròyìn àwọn àyípadà ìṣètò tí a ṣàkíyèsí nínú ìwádìí yìí tẹ́lẹ̀. Àwọn wọ̀nyí ní ìṣètò ìparẹ́ QB láti Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) àti Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), gbogbo èyí tí ó fẹ́rẹ̀ẹ́ jọ ìṣètò QB gbogbo wọn. Ṣíṣàyẹ̀wò 3PRC fihàn pé àwọn molecule ìwẹ̀ LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) so mọ́ ẹnu ọ̀nà ipò QB, èyí tí ó lè dènà àtúntò sí ìṣètò tí a ti sé mọ́. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé LDAO kò bàjẹ́ ní ipò kan náà ní 1EYS tàbí 1OGV, a ṣe àwọn RC wọ̀nyí nípa lílo ìwẹ̀ kan náà, nítorí náà ó lè mú ìyọrísí kan náà jáde. Ìṣètò kirisita ti Rba. Sphaeroides RC tí a fi cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) ṣe pẹ̀lú crystall pẹ̀lú rẹ̀ tún dàbí ẹni pé ó ní ojú ọ̀nà QB tí a ti pa. Síbẹ̀síbẹ̀, nínú ọ̀ràn yìí, agbègbè N-terminal ti polypeptide RC-M (tí ó ń bá ojú ọ̀nà ìsopọ̀ QB lò nípasẹ̀ ìdè H ti Tyr residue lórí Q helix) gba ìrísí àìdá, a kò sì tún ṣe àwárí ìyípadà ìrísí QB mọ́ (30). Ohun tí ó ń fúnni ní ìfọ̀kànbalẹ̀ ni pé a kò tíì rí irú ìyípadà yìí ti polypeptide M nínú ìṣètò RC-LH114-W, èyí tí ó fẹ́rẹ̀ẹ́ jẹ́ ọ̀kan náà pẹ̀lú agbègbè N-terminal ti RC-LH116 RC. Ó yẹ kí a tún kíyèsí pé lẹ́yìn píparẹ́ eriali LH1 tí a fi ọṣẹ ṣe, a ti yanjú àwọn RC apolipoprotein nínú PDB, èyí tí ó mú àwọn adágún quinone inú àti àwọn lipids kúrò nínú àlàfo láàárín RC àti ojú inú ti òrùka LH1 tí ó yí i ká (31, 32). RC ṣì ń ṣiṣẹ́ nítorí pé ó ń pa gbogbo àwọn ohun èlò ìsopọ̀ mọ́, àyàfi quinone QB tí ó lè bàjẹ́, èyí tí kò dúró ṣinṣin tí ó sì sábà máa ń pàdánù nígbà ìpèsè (33). Ní ​​àfikún, a mọ̀ pé yíyọ LH1 àti àwọn lipids cyclic adayeba kúrò nínú RC lè ní ipa lórí àwọn iṣẹ́, bí ìgbà tí ó kúrú fún P+QB-state tí a yà sọ́tọ̀ (31, 34, 35). Nítorí náà, a ṣe àkíyèsí pé wíwà òrùka LH1 agbègbè tí ó yí RC ká lè pa ojú òpó QB “tí a ti pa” mọ́, nípa bẹ́ẹ̀ ó ń pa àyíká agbègbè mọ́ nítòsí QB.
Bó tilẹ̀ jẹ́ pé apolipoprotein (láìsí QB quinone) àti ìṣètò pípé náà dúró fún àwòrán méjì péré ti ìyípadà ojú òpó QB, dípò àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ kan, àwọn àmì kan wà pé ìdè náà lè dènà àtúnṣe láti ọwọ́ hydroquinone. Láti dènà ìdíwọ́ substrate. Ìbáṣepọ̀ quinolol àti quinone nítòsí ojú òpó QB ti apolipoprotein lè yàtọ̀, èyí tí ó yọrí sí ìkọ̀sílẹ̀ rẹ̀ láti ọwọ́ RC. Ó ti pẹ́ tí a ti dámọ̀ràn pé àwọn ìyípadà ìṣètò ń kó ipa nínú ìdè àti ìdínkù àwọn quinone. Agbára àwọn RC tí ó dìdì láti dín àwọn quinone kù lẹ́yìn ìyípadà dúdú ti bàjẹ́ (36); X-ray crystallography fihàn pé ìbàjẹ́ yìí jẹ́ nítorí pé àwọn quinone QB wà nínú ìṣètò “ìjìnnà” nípa 4.5 Å láti ipò proximal tí ń ṣiṣẹ́ (26), 37). A dámọ̀ràn pé ìṣètò ìdènà jíjìn yìí jẹ́ àwòrán ipò àárín láàárín apolipoprotein àti ìṣètò ìjókòó pípé, èyí tí ó tẹ̀lé ìbáṣepọ̀ àkọ́kọ́ pẹ̀lú quinone àti ṣíṣí ojú òpó QB.
Iru RC II ti a rii ninu eka PSII ti awọn kokoro arun phototrophic kan ati cyanobacteria, ewe ati awọn eweko ni itọju eto ati iṣẹ-ṣiṣe (38). Itoju eto ti a fihan ni Aworan 6 (D ati E) tẹnumọ ibajọra laarin awọn RC PSII ati aaye QB ti eka RC kokoro arun. Ifiweranṣẹ yii ti jẹ apẹẹrẹ fun igba pipẹ fun ikẹkọ awọn eto ti o ni ibatan pẹkipẹki ti isopọmọ quinone ati idinku. Awọn atẹjade ti tẹlẹ daba pe awọn iyipada ti o wa ni ipo pẹlu idinku PSII ti awọn quinones (39, 40). Nitorinaa, ni akiyesi itọju itankalẹ ti RC, ilana isopọmọ ti a ko rii tẹlẹ yii le tun wulo fun aaye QB ti PSII RC ninu awọn eweko phototrophic ti o ni atẹgun.
Rps ΔpufW (ìparẹ́ pufW tí a kò fi àmì sí) àti PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W tí a fihàn láti inú àwọn ẹ̀yà pufW adayeba). a ṣe àpèjúwe palustris CGA009 nínú iṣẹ́ wa tí ó ṣáájú (16). A rí àwọn ẹ̀yà wọ̀nyí àti òbí irú-ilẹ̀ ìgbẹ́ tí a fi ìgbẹ́ sí láti inú firisa nípa fífi àwọn sẹ́ẹ̀lì díẹ̀ sí orí PYE (5 g lita -1 kọ̀ọ̀kan) (tí a tọ́jú sínú LB ní -80 °C, tí ó ní 50% (w/v) protein glycerol), yeast extract àti succinate) agar [1.5% (w/v)] àwo. A fi àwo náà sínú òkùnkùn ní òru kan ní iwọ̀n otútù yàrá lábẹ́ àwọn ipò anaerobic, lẹ́yìn náà a fi ìmọ́lẹ̀ funfun (~50 μmolm-2 s-1) tí OSRAM 116-W halogen bulbs (RS Components, UK) pèsè fún ọjọ́ mẹ́ta sí márùn-ún títí tí ìṣètò kan fi fara hàn. A lo ileto kan ṣoṣo lati fi abẹ́rẹ́ M22+ alabọde 10 milimita (41) ti a fi 0.1% (w/v) casamino acids kun (eyi ti a n pe ni M22 lẹhin). A gbin asa naa labẹ ipo atẹgun kekere ni okunkun ni 34°C pẹlu gbigbọn ni 180 rpm fun wakati 48, lẹhinna a fi 70 milimita asa naa sinu abẹ́rẹ́ labẹ awọn ipo kanna fun wakati 24. A lo asa semi-aerobic pẹlu iwọn didun 1 milimita lati fi abẹ́rẹ́ M22 alabọde 30 milimita sinu igo gilasi ti o ni 30 milimita ti o han gbangba ti a si fi abẹ́rẹ́ (~50μmolm-2 s-1) fun wakati 48 nipasẹ agbara oofa ti ko ni ajẹsara Stirring rod. Lẹhinna a fi 30 milimita asa naa sinu abẹ́rẹ́ pẹlu nipa 1 lita asa labẹ awọn ipo kanna, eyiti a lo lẹhinna lati fi abẹ́rẹ́ to bi 9 lita asa ti a tan imọlẹ ni ~200 μmolm-2 s-1 fun wakati 72. A kó àwọn sẹ́ẹ̀lì náà jáde nípa centrifugation ní 7132 RCF fún ìṣẹ́jú 30, a tún fi sínú ~10 milimita ti 20 mM tris-HCl (pH 8.0), a sì tọ́jú wọn sí -20°C títí tí ó fi yẹ.
Lẹ́yìn tí ó bá ti yọ́, fi àwọn kirisita deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) àti àwọn tábìlì Roche holoenzyme protease inhibitor méjì (Merck, UK) kún àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a tún ti yọ́. Nínú sẹ́ẹ̀lì titẹ French psi 20,000 psi (Aminco, USA), àwọn sẹ́ẹ̀lì náà ni a bàjẹ́ ní ìgbà 8 sí 12. Lẹ́yìn tí a ti yọ àwọn sẹ́ẹ̀lì tí kò ti bàjẹ́ àti àwọn ìdọ̀tí tí kò lè yọ́ kúrò nípa centrifugation ní 18,500 RCF fún ìṣẹ́jú 15 ní 4°C, a ti yọ àwọ̀ ara náà kúrò nínú lysate aláwọ̀ nípa centrifugation ní 113,000 RCF fún wákàtí 2 ní 43,000°C. Jù ìpín tí ó lè yọ́ kúrò kí o sì tún fi àwọ̀ ara náà sí 100 sí 200 milimita ti 20 mM tris-HCl (pH 8.0) kí o sì dà á pọ̀ mọ́ ara títí tí kò fi sí àwọn àkópọ̀ tí a lè rí. A fi 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) tí ó ní 2% (w/v) β-DDM sínú àwọ̀ ara tí a ti dì mọ́ ara rẹ̀ fún wákàtí kan nínú òkùnkùn ní 4°C pẹ̀lú ìrọ̀rùn díẹ̀díẹ̀. Lẹ́yìn náà, a fi centrifuge sí 70°C láti yọ́ 150,000 RCF ní 4°C fún wákàtí kan láti mú àwọn ohun tí kò lè yọ́ kúrò.
A fi awọ ara ti o n yọ kuro ninu iru ΔpufW sori ọwọn iyipada ion DEAE Sepharose 50 milimita pẹlu awọn iwọn ọwọn mẹta (CV) ti buffer ti o n so [20 mM tris-HCl (pH 8.0) ti o ni 0.03% (w / v) β-DDM]. Fọ ọwọn naa pẹlu awọn buffer ti o n so CV meji, lẹhinna fọ ọwọn naa pẹlu awọn buffer ti o n so meji ti o ni 50 mM NaCl. A fi gradient linear ti 150 si 300 mM NaCl (ninu buffer ti o n so) sori 1.75 CV, ati pe a fi buffer ti o n so iyoku ti o ni 300 mM NaCl sori 0.5 CV sori 0.5 CV. Gba ìpele ìfàmọ́ra láàárín 250 àti 1000 nm, pa ìpín pẹ̀lú ìpín ìfàmọ́ra (A880/A280) mọ́ ju 1 lọ ní 880 sí 280 nm, pò ó pọ̀ ní ìlọ́po méjì nínú ìfàmọ́ra ìsopọ̀, kí o sì tún lo ìlànà kan náà lórí ọ̀wọ́n DEAE On cleansing. Fọ àwọn ìpín pẹ̀lú ìpín A880/A280 tí ó ga ju 1.7 àti A880/A805 tí ó ga ju 3.0 lọ, ṣe ìpele kẹta ti ìyípadà ion, kí o sì pa àwọn ìpín pẹ̀lú ìpín A880/A280 tí ó ga ju 2.2 àti A880/A805 tí ó ga ju 5.0 lọ mọ́. A kó àkójọpọ̀ tí a ti sọ di mímọ́ díẹ̀ sí ~2 milimita nínú àlẹ̀mọ́ centrifugal Amicon 100,000 molikula (MWCO) (Merck, UK), a sì gbé e sórí ọ̀wọ́n ìyọkúrò iwọn Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) tí ó ní 200 mM NaCl buffer, lẹ́yìn náà a yọ ọ́ kúrò nínú buffer kan náà ní 1.5 CV. Gba ìyọkúrò ìyọkúrò iwọn náà, kí o sì so ìyọkúrò ìyọkúrò ìyọkúrò pọ̀ mọ́ ìyọkúrò ìyọkúrò pẹ̀lú ìyọkúrò A880/A280 lórí ìyọkúrò 2.4 àti A880/A805 lórí ìyọkúrò 5.8 sí 100 A880, kí o sì lò ó lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ fún ìpèsè tàbí ìtọ́jú ìpele cryo-TEM. Tọ́jú sí -80°C títí tí ó fi yẹ.
A fi awọ ara ti o n yọ omi kuro ninu PufW-His si ori 20 milimita HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8.0) ti o ni 200 mM NaCl ati 0.03% (w/w)) ninu IMAC buffer (GE Healthcare). v) β-DDM). A fi CV marun ti IMAC buffer fọ ọwọn naa, lẹhinna a fi CV marun ti IMAC buffer ti o ni 10 mM histidine kuro ninu ọwọn naa. A yọ eka inu rẹ kuro ninu ọwọn naa pẹlu awọn buffer IMAC marun ti o ni histidine 100 mM. A da ipin ti o ni eka RC-LH114-W pọ si ~10 milimita ninu ojò ti a ti ru pẹlu àlẹmọ Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), a fi buffer ti o so mọ igba 20, lẹhinna a fi kun 25 milimita Ninu ọwọn DEAE Sepharose, a lo awọn CV mẹrin ti a so mọ buffer ni iṣaaju. Fọ ọ̀wọ̀n náà pẹ̀lú àwọn ohun èlò ìdènà CV mẹ́rin, lẹ́yìn náà yọ gbogbo rẹ̀ kúrò lórí àwọn CV mẹ́jọ lórí ìlà ìlà ti NaCl 0 sí 100 mM (nínú ìdènà), àti àwọn CV mẹ́rin tó kù tí ó ní ohun èlò ìdènà 100 mM. Àwọn ohun èlò ìyókù tí a yọ jáde lórí sodium chloride tí a so pọ̀ mọ́ ìpíndọ́gba A880/A280 tí ó ga ju 2.4 lọ àti ìpíndọ́gba A880/A805 tí ó ga ju ìpíndọ́gba 4.6 lọ ni a kó jọ sí ~2 milimita nínú àlẹ̀mọ́ centrifugal Amicon 100,000 MWCO, a sì fi IMAC 1.5 CV kún un ṣáájú. Buffer tí ó ní ìwọ̀n Superdex 200 16/600, lẹ́yìn náà ó yọ kúrò nínú ohun èlò ìdènà kan náà lórí 1.5 CV. Kó àwọn ìpele ìfàmọ́ra ti àwọn ìpín ìyọkúrò ìwọ̀n jọ kí o sì kó àwọn ìpele ìfàmọ́ra pọ̀ mọ́ àwọn ìpele ìfàmọ́ra pẹ̀lú àwọn ìpele A880/A280 lórí àwọn ìpele 2.1 àti A880/A805 lórí àwọn ìpele 4.6 sí 100 A880, èyí tí a ń lò lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ fún ìpèsè àwọ̀n TEM tí ó dìdì tàbí tí a tọ́jú ní -80°C títí tí a ó fi nílò rẹ̀.
Wọ́n lo firisa Leica EM GP láti pèsè àwọn àwọ̀n TEM tí ó ní ìwọ̀n otútù díẹ̀. Wọ́n fi omi pò àpò náà nínú IMAC buffer sí A880 ti 50, lẹ́yìn náà wọ́n gbé 5μl sórí àpò bàbà tí a fi QUANTIFOIL 1.2/1.3 tí a fi carbon bo (Agar Scientific, UK) tí ó ṣẹ̀ṣẹ̀ yọ jáde tí ó sì ní ìmọ́lẹ̀ (Green). Fi 20°C àti ọriniinitutu 60% sínú rẹ̀ fún ìṣẹ́jú 30, lẹ́yìn náà, wọ́n fi pamọ́ sínú rẹ̀ fún ìṣẹ́jú 3, lẹ́yìn náà wọ́n pa á nínú ethane olómi ní -176°C.
A gba data ti eka RC-LH114-W silẹ lori eBIC (Ile-iṣẹ Itanna Bioimaging) (Orisun Imọlẹ Diamond ti Ilu Gẹẹsi) pẹlu maikirosikopu Titan Krios, eyiti o ṣiṣẹ ni foliteji iyara ti 300kV, pẹlu iwọn giga ti 130,000 × ati agbara ti - Yan aaye ti 20 eV. A lo Gatan 968 GIF Quantum pẹlu ẹrọ wiwa oke K2 lati gbasilẹ awọn aworan ni ipo kika lati gba data. Iwọn pixel ti a ṣe deede jẹ 1.048Å, ati oṣuwọn iwọn lilo jẹ 3.83 e-Å-2s-1. Gba fiimu naa ni awọn iṣẹju-aaya 11 o si pin si awọn apakan 40. Lo agbegbe ti a bo erogba lati tun idojukọ maikirosikopu naa, lẹhinna gba awọn fiimu mẹta fun iho kan. Ni apapọ, a gba awọn fiimu 3130, pẹlu awọn iye defocus laarin -1 ati -3μm.
A gba data fun eka RC-LH116 naa nipa lilo microscope kanna ni Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, UK). A gba data naa ni ipo kika pẹlu iwọn giga ti 130 k, a si ṣe iwọn iwọn pixel si 1.065 Å pẹlu iwọn lilo ti 4.6 e-Å-2s-1. A gba fiimu naa silẹ ni awọn aaya 12 a si pin si awọn apakan 48. Ni apapọ, a gba awọn fiimu 3359, pẹlu awọn iye defocus laarin -1 ati -3μm.
Gbogbo ìṣiṣẹ́ ìwádìí dátà ni a ṣe nínú ọ̀nà ìṣiṣẹ́ Relion 3.0 (42). Lo Motioncorr 2 (43) láti ṣe àtúnṣe ìṣípo bọ́ọ̀lù nípa lílo ìwọ̀n ìwọ̀n, lẹ́yìn náà lo CTFIND 4.1 (44) láti pinnu ìpínrọ̀ CTF (iṣẹ́ ìyípadà ìyàtọ̀). Àwọn fọ́tòmikrófágù tí ó wọ́pọ̀ lẹ́yìn àwọn ìpele ìṣiṣẹ́ àkọ́kọ́ wọ̀nyí ni a fihàn ní Àwòrán 2. S16. A ṣe àgbékalẹ̀ àwòṣe yíyàn aládàáṣe nípa yíyan nǹkan bíi 250 píksẹ́lì ti 1000 píksẹ́lì nínú fírẹ́mù 250-píksẹ́lì àti pé kò sí ìsọ̀rí onípele méjì (2D), nípa bẹ́ẹ̀ a kò gba àwọn ìpínsísọ tí ó bá ìbàjẹ́ àpẹẹrẹ mu tàbí tí kò ní àwọn ànímọ́ tí a lè rí. Lẹ́yìn náà, a ṣe yíyàn aládàáṣe lórí gbogbo àwọn fọ́tòfírófágù, RC-LH114-W sì jẹ́ 849,359 píksẹ́lì, àti RC-LH116 jẹ́ 476,547 píksẹ́lì. Gbogbo àwọn patikulu tí a yàn ti ṣe ìpele méjì ti ìpínsísọ 2D tí kò ní ìtọ́kasí, àti lẹ́yìn ìṣiṣẹ́ kọ̀ọ̀kan, àwọn patikulu tí ó bá agbègbè erogba mu, ìbàjẹ́ àpẹẹrẹ, àwọn ẹ̀yà ara tí ó hàn gbangba tàbí àwọn patikulu tí ó bò ara wọn gidigidi ni a kọ̀, èyí tí ó yọrí sí 772,033 (90.9%) àti 359,678 (75.5%) ) ni a lò fún ìpínsísọ 3D ti RC-LH114-W àti RC-LH116 lẹ́sẹẹsẹ. A ṣe àwòṣe ìtọ́kasí 3D àkọ́kọ́ nípa lílo ọ̀nà ìsọ̀kalẹ̀ stochastic gradient. Nípa lílo àwòṣe àkọ́kọ́ gẹ́gẹ́ bí ìtọ́kasí, a pín àwọn patikulu tí a yàn sí ẹ̀ka mẹ́rin nínú 3D. Nípa lílo àwòṣe nínú ẹ̀ka yìí gẹ́gẹ́ bí ìtọ́kasí, ṣe ìtúnṣe 3D lórí àwọn patikulu tí ó wà nínú ẹ̀ka tí ó tóbi jùlọ, lẹ́yìn náà lo àlẹ̀mọ́ low-pass 15Å àkọ́kọ́ láti bo agbègbè solvent, fi àwọn piksẹli 6 ti àwọn egbegbe rírọ kún un, kí o sì ṣe àtúnṣe àwọn piksẹli náà láti ṣe àtúnṣe iṣẹ́ ìyípadà Modulation peak Gatan K2 ti detector òkè. Fún àkójọpọ̀ RC-LH114-W, a ṣe àtúnṣe àwòṣe àkọ́kọ́ yìí nípa yíyọ ìwọ̀n líle ní etí ìbòjú náà kúrò (tí a ti yọ kúrò nínú ìwọ̀n ìṣọ̀kan mojuto nínú UCSF Chimera). Àwọn àwòṣe tí ó jáde (àwọn ìpinnu RC-LH114-W àti RC-LH116 jẹ́ 3.91 àti 4.16 Å, lẹ́sẹẹsẹ) ni a lò gẹ́gẹ́ bí ìtọ́kasí fún ìpele kejì ti ìpínsísọ 3D. Àwọn èròjà tí a lò ni a kó jọ sínú kilasi 3D àkọ́kọ́ wọn kò sì ní ìbáṣepọ̀ tó lágbára pẹ̀lú àdúgbò náà. Ìdàpọ̀ tàbí àìsí àwọn ànímọ́ ìṣètò tí ó hàn gbangba. Lẹ́yìn ìpele kejì ti ìpínsísọ 3D, a yan ẹ̀ka tí ó ní ìpinnu gíga jùlọ [Fún RC-LH114-W, ẹ̀ka kan jẹ́ 377,703 èròjà (44.5%), fún RC-LH116, àwọn ẹ̀ka méjì ló wà, tí ó jẹ́ 260,752 èròjà (54.7%) , Níbi tí wọ́n bá jọra nígbà tí a bá ṣe àtúnṣe lẹ́yìn ìyípo àkọ́kọ́ pẹ̀lú ìyàtọ̀ kékeré]. A tún fa àwọn èròjà tí a yàn jáde nínú àpótí 400-pixel, a sì tún un ṣe pẹ̀lú àtúnṣe 3D. A ń ṣe àfihàn ìbòjú solvent nípa lílo àlẹ̀mọ́ low-pass 15Å àkọ́kọ́, ìfẹ̀sí maapu 3 pixel àti ìbòjú soft 3 pixel. Nípa lílo àtúnṣe CTF per-particle, àtúnṣe ìṣípo per-particle àti ìyípo kejì ti àtúnṣe per-particle CTF, àtúnṣe 3D, ìbòjú solvent àti ìṣiṣẹ́ lẹ́yìn ìgbésẹ̀ kọ̀ọ̀kan láti túbọ̀ ṣe àtúnṣe sí ìrísí tí ó jáde. Nípa lílo iye gígé FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) ti 0.143, àwọn ìpinnu ti àwọn àpẹẹrẹ ìkẹyìn ti RC-LH114-W àti RC-LH116 jẹ́ 2.65 àti 2.80Å, lẹ́sẹẹsẹ. A fi ìlà FSC ti àpẹẹrẹ ìkẹyìn hàn ní Àwòrán 2. S17.
Gbogbo àwọn ìtẹ̀léra amuaradagba ni a gba láti ọ̀dọ̀ UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). A lo SWISS-MODEL (45) láti kọ́ àwòṣe ìbáramu ti RC, èyí tí ó ní àwọn ìtẹ̀léra amuaradagba ti RC-L, RC-M àti RC-H nínú àti ìṣètò kristali ti Rba. sphaeroides RC gẹ́gẹ́ bí àwòṣe (PDB ID: 5LSE) (46). Lo irinṣẹ́ “fit map” nínú UCSF Chimera láti fi àwòrán tí a ṣẹ̀dá sí àwòrán náà (47), láti mú ìṣètò amuaradagba sunwọ̀n síi, àti láti fi cofactor [4×BChl a (monomer library residue name = BCL), 2×BPh a (BPH), irú UQ10 kan tàbí méjì (U10), irin tí kìí ṣe heme kan (Fe) àti 3,4-dihydrohexacarbonylcholine kan (QAK)] kún un. Lo Coot (48) láti fi kún un. Níwọ́n ìgbà tí QAK kò sí ní ilé ìkàwé monomer, a fi paramita ṣe é nípa lílo irinṣẹ́ eLBOW nínú PHENIX (49).
Lẹ́yìn náà, a kọ́ ẹ̀ka LH1. Ní àkọ́kọ́, a lo irinṣẹ́ ìkọ́lé aládàáṣe nínú PHENIX (49) láti ṣe apá kan ẹ̀ka LH1 láìdáwọ́dúró nípa lílo máàpù àti àwọn ẹ̀ka prótínì LH1-α àti LH1-β gẹ́gẹ́ bí ìtẹ̀síwájú. Yan ẹ̀ka LH1 tó pé jùlọ, yọ ọ́ jáde kí o sì fi sínú Coot, fi ìtẹ̀síwájú tó sọnù sínú rẹ̀ pẹ̀lú ọwọ́, kí o sì tún gbogbo ẹ̀ka náà ṣe pẹ̀lú ọwọ́ kí o tó fi BCls a (BCL) méjì àti spirilloxanthin (CRT) kún un [gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n Rps ti àkópọ̀ LH1 tó yẹ àti àkóónú carotenoid tí a mọ̀. Irú (17)]. Da ẹ̀ka LH1 tó pé, kí o sì lo ẹ̀ka UCSF Chimera “Docking Map Tool” láti gúnlẹ̀ sí agbègbè tí kì í ṣe àwòṣe ti LH1 density tó wà nítòsí, lẹ́yìn náà tún un ṣe ní Coot; tún ṣe ilana náà títí gbogbo ẹ̀ka LH1 yóò fi di àpẹẹrẹ. Fún ìṣètò RC-LH114-W, nípa yíyọ ìwọ̀n tí a kò pín sí Coot, a pín amuaradagba náà sí méjì láti inú àwọn èròjà tí kìí ṣe amuaradagba tó kù nínú àwòrán USCF Chimera àti pé a lo irinṣẹ́ Autobuild láti fi àpẹẹrẹ àkọ́kọ́ múlẹ̀, àti àwọn ìpín kéékèèké tó kù (protein-W) Modeling. Nínú PHENIX (49). Fi èyíkéyìí ìtẹ̀léra tó sọnù kún àpẹẹrẹ tó jáde nínú Coot (48), lẹ́yìn náà, fi ọwọ́ ṣe àtúnṣe gbogbo ìpín kéékèèké náà. Ìwọ̀n tí kò pín sí ìyókù bá àpapọ̀ àwọn lipids mu (PDB monomer library ID ti CDL = CDL, POPC = 6PL àti POPG = PGT), ọṣẹ β-DDM (LMT) àti àwọn molecules UQ10 (U10). Lo ìṣelọ́pọ́ PHENIX (49) àti ìṣelọ́pọ́ ọwọ́ nínú Coot (48) láti ṣe àtúnṣe àwòrán ìbẹ̀rẹ̀ pípé títí tí àwọn statistiki àwòrán àti dídára ìrísí ìbáramu kò fi ní lè sunwọ̀n sí i. Níkẹyìn, lo LocScale (50) láti mú àwòrán agbègbè náà gbóná, lẹ́yìn náà ṣe ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ìyípo míràn ti ṣíṣe àwòṣe ìwọ̀n tí a kò pín sí ìyókù àti ìṣelọ́pọ́ aládàáṣe àti afọwọ́ṣe.
Àwọn peptides, cofactors àti àwọn lipids àti quinones mìíràn tí a dì mọ́ ara wọn ni a fihàn ní Àwòrán 1 àti 2. S18 sí S23. Ìwífún ìṣirò ti àwòṣe ìkẹyìn ni a fihàn nínú Táblì S1.
Àyàfi tí a bá sọ ọ́ di mímọ̀, a kó àwọn ìpele ìfàmọ́ra UV/Vis/NIR jọ sórí Cary60 spectrophotometer (Agilent, USA) ní àkókò 1 nm láti 250 nm sí 1000 nm àti àkókò ìṣọ̀kan 0.1s.
Fọ àpẹẹrẹ náà sínú quartz cuvette pẹ̀lú ipa ọ̀nà 2 mm sí A880 ti 1, kí o sì kó ìpele ìfàmọ́ra láàrín 400 àti 1000 nm jọ. A kó àwọn ìpele dichroic circular spectra jọ sórí spectropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Japan) ní ààrín 1 nm láàrín 400 nm àti 950 nm ní ìwọ̀n ìṣàyẹ̀wò ti 20 nm min-1.
A pinnu iye ìparẹ́ molar nípa pípa àkópọ̀ mojuto pọ̀ mọ́ A880 tó tó nǹkan bí 50. Tú ìwọ̀n 10μl sínú 990μl binding buffer tàbí methanol, kí o sì kó ìparẹ́ absorption spectrum jọ lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ láti dín ìparẹ́ BChl kù. A ṣírò iye BChl ti àpẹẹrẹ methanol kọ̀ọ̀kan nípa lílo iye ìparẹ́ ní 771 nm ti 54.8 mM-1 cm-1, a sì pinnu iye ìparẹ́ (51). Pín ìfojúsùn BChl tí a wọ̀n nípa 32 (RC-LH114-W) tàbí 36 (RC-LH116) láti pinnu iye ìparẹ́ core complex, èyí tí a ń lò lẹ́yìn náà láti pinnu iye ìparẹ́ absorption ti àpẹẹrẹ kan náà tí a kó jọ nínú iye ìparẹ́ buffer Extinction. parallel. A ṣe àwọn ìwọ̀n mẹ́ta tí a tún ṣe fún àpẹẹrẹ kọ̀ọ̀kan, a sì lo ìwọ̀n ìparẹ́ àròpín ti o pọju BChl Qy fún ìṣirò. Iye ìpínsọpọ̀ ìparun ti RC-LH114-W tí a wọn ní 878 nm jẹ́ 3280±140 mM-1 cm-1, nígbà tí iye ìpínsọpọ̀ ìparun ti RC-LH116 tí a wọn ní 880 nm jẹ́ 3800±30 mM-1 cm-1.
A ṣe iye UQ10 gẹ́gẹ́ bí ọ̀nà tí a gbà ṣe é ní (52). Ní ​​kúkúrú, a ṣe HPLC ìpele ìyípadà (RP-HPLC) nípa lílo ètò Agilent 1200 HPLC. Tú nǹkan bí 0.02 nmol ti RC-LH116 tàbí RC-LH114-W nínú 50μl ti 50:50 methanol:chloroform tí ó ní 0.02% (w/v) ferric chloride, kí o sì fi abẹ́rẹ́ Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm Tú nínú 1 ml-1 min-1 ní 40°C nínú solvent HPLC (80:20 methanol:2-propanol) lórí ọ̀wọ́n ×25 cm kan. Ṣe isocratic exlution nínú solvent HPLC láti ṣe àyẹ̀wò absorbance ní 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) àti 780 nm (BChl) fún wákàtí kan. A so oke ti o wa ninu chromatogram 275 nm ni iṣẹju 25.5 pọ, eyiti ko ni awọn agbo ogun miiran ti a le rii. A lo agbegbe ti a ṣepọ lati ṣe iṣiro iye molar ti UQ10 ti a yọ kuro pẹlu itọkasi si ilawọn iṣiro ti a ṣe iṣiro lati abẹrẹ awọn iṣedede mimọ lati 0 si 5.8 nmol (Aworan S14). A ṣe itupalẹ ayẹwo kọọkan ni awọn atunṣe mẹta, ati aṣiṣe ti a royin baamu pẹlu SD ti apapọ.
A pese ojutu kan ti o ni eka RC-LH1 pẹlu gbigba Qy ti o pọju ti 0.1 pẹlu cytochrome heart ti o dinku 30 μM (Merck, UK) ati 0 si 50 μMUQ2 (Merck, UK). A pese awọn ayẹwo 1-ml mẹta ni ifọkansi UQ2 kọọkan ati a fi sinu ina ni alẹ ni dudu ni 4°C lati rii daju pe o baamu patapata si okunkun ṣaaju wiwọn. A gbe ojutu naa sinu spectrophotometer modular OLIS RSM1000 ti a pese pẹlu grating ina/500 laini 300 nm, ẹnu-ọna 1.24 mm, awọn slits aarin 0.12 mm ati awọn iho ita 0.6 mm. A gbe àlẹmọ gigun 600 nm si ẹnu-ọna phototube ayẹwo ati tube photomultiplier itọkasi lati yọkuro ina excitation. A ṣe abojuto absorbance naa ni 550 nm pẹlu akoko isọdọkan ti 0.15 s. A máa ń tú iná ìgbóná jáde láti inú LED M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) nípasẹ̀ okùn okùn optic kan ní agbára 90% nípasẹ̀ olùdarí DC2200 kan (Thorlabs Ltd., UK) a sì máa ń tú u jáde sí orísun ìmọ́lẹ̀ ní igun 90° ti. Ìlà ìwọ̀n náà lòdì sí dígí láti dá ìmọ́lẹ̀ tí àpẹẹrẹ náà kò gbà padà. Ṣe àkíyèsí ìgbóná náà ní ìṣẹ́jú 10 kí ìmọ́lẹ̀ náà tó di ìṣẹ́jú 50. Lẹ́yìn náà, a tún ń ṣe àkíyèsí ìgbóná náà fún ìṣẹ́jú 60 nínú òkùnkùn láti ṣe àyẹ̀wò bí quinolol ṣe dín cytochrome c23 + kù láìròtẹ́lẹ̀ (wo Àwòrán S8 fún ìwífún tí a kò rí).
A ṣe àgbékalẹ̀ ìwádìí náà nípa fífi ìwọ̀n ìbẹ̀rẹ̀ ìlà kan láàrín 0.5 sí 10 s (gẹ́gẹ́ bí ìṣọ̀kan UQ2 ṣe rí) àti àròpín ìwọ̀n gbogbo àwọn àpẹẹrẹ mẹ́ta ní ìṣọ̀kan UQ2 kọ̀ọ̀kan. A lo ìṣọ̀kan RC-LH1 tí a ṣírò nípasẹ̀ ìṣọ̀kan ìparun kọ̀ọ̀kan láti yí ìwọ̀n náà padà sí ìṣedéédé catalytic, tí a ṣe àwòrán rẹ̀ nínú Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), a sì fi mọ́ àwòṣe Michaelis-Menten láti pinnu àwọn ìwọ̀n Km àti Kcat tí ó hàn gbangba.
Fún ìwọ̀n ìfàmọ́ra ìgbà díẹ̀, a ti pò àyẹ̀wò RC-LH1 pọ̀ sí ~2μM nínú IMAC buffer tí ó ní sodium ascorbate 50 mM (Merck, USA) àti 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). A ń lo Ascorbic acid gẹ́gẹ́ bí olùfúnni elekitironi tí a fi rúbọ, a sì ń lo tert-butaclofen gẹ́gẹ́ bí olùdínà QB láti rí i dájú pé olùfúnni RC pàtàkì dúró díẹ̀ (ìyẹn ni pé, kì í ṣe pé a ti fi photooxidized ṣe é) jálẹ̀ ìlànà ìwọ̀n náà. A fi nǹkan bí 3 milimita ti àyẹ̀wò kún sẹ́ẹ̀lì yíyípo àdáni kan (ní nǹkan bí 0.1 m ní ìwọ̀n ìlà, 350 RPM) pẹ̀lú gígùn ọ̀nà optical 2 mm láti rí i dájú pé àyẹ̀wò tí ó wà ní ipa ọ̀nà laser ní àkókò tó láti mú kí àyípadà dúdú láàrín àwọn ìlù ìtara. Lo àwọn ìlù laser ~100-fs láti mú kí ètò laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) pọ̀ sí i láti mú àyẹ̀wò náà rú ní 880 nm ní ìwọ̀n àtúnsọ ti 1 kHz (20 nJ fún NIR tàbí 100 nJ fún Vis). Kí o tó kó ìwífún jọ, fi àyẹ̀wò náà hàn sí ìmọ́lẹ̀ ìgbóná fún bí ìṣẹ́jú 30. Ìfarahàn yóò fa ìdènà QA (ó ṣeé ṣe kí ó dín QA kù lẹ́ẹ̀kan tàbí lẹ́ẹ̀mejì). Ṣùgbọ́n jọ̀wọ́ kíyèsí pé ìlànà yìí lè yí padà nítorí lẹ́yìn ìgbà pípẹ́ ti ìyípadà dúdú, RC yóò padà díẹ̀díẹ̀ sí iṣẹ́ QA. A lo Helios spectrometer (Ultrafast Systems, USA) láti wọn ìwífún ìgbà díẹ̀ pẹ̀lú àkókò ìdádúró ti -10 sí 7000 ps​​. Lo sọfítíwè Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) láti tú àwọn ìwífún kúrò, lẹ́yìn náà dapọ̀ kí o sì ṣe àtúnṣe. Lo package sọfítíwè CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) láti lo àpapọ̀ ìwífún láti gba ìwífún ìyàtọ̀ tí ó ní í ṣe pẹ̀lú ìbàjẹ́, tàbí lo iṣẹ́ kan tí ó ní ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìwífún pẹ̀lú ìdáhùn ohun èlò láti bá ìdàgbàsókè ìwífún ìgbà kan ṣoṣo mu ní Origin (OriginLab, USA).
Gẹ́gẹ́ bí a ti sọ lókè (53), a ṣe fíìmù fọ́tòsíntẹ́ẹ̀tì kan tí ó ní àkópọ̀ LH1 tí kò ní eriali RC àti ti ẹ̀gbẹ́ LH2. A fi omi pò awọ ara náà ní 20 mM tris (pH 8.0) lẹ́yìn náà a gbé e sínú quartz cuvette pẹ̀lú ipa ọ̀nà optical 2 mm. A lo pulse lesa 30nJ láti ru àyẹ̀wò náà sókè ní 540 nm pẹ̀lú àkókò ìdádúró -10 sí 7000 ps. Ṣe àgbékalẹ̀ ìtò data gẹ́gẹ́ bí a ṣe ṣàlàyé fún àyẹ̀wò Rps. pal.
A fi centrifugation ní 150,000 RCF pa awọ ara náà fún wákàtí méjì ní 4°C, lẹ́yìn náà a tún fi 20 mM tris-HCl (pH 8.0) àti 200 mM NaCl kún awọ ara náà. Tú awọ ara náà nípa fífi 2% (w/v) β-DDM rọ́pò díẹ̀díẹ̀ fún wákàtí kan nínú òkùnkùn ní 4°C. A fi 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) pò ó sí ìwọ̀n amuaradagba ti 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad analysis). A tún ṣe àtúnṣe sí i láti ọ̀nà tí a tẹ̀ jáde tẹ́lẹ̀ (54), bẹ̀rẹ̀ pẹ̀lú ìpara amuaradagba 50 μg sí àpapọ̀ 50 μl TEAB tí ó ní 1% (w/v) sodium laurate (Merck, UK). Lẹ́yìn ìtọ́jú sonication fún ìṣẹ́jú 60, a dín in kù pẹ̀lú 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) ní 37°C fún ìṣẹ́jú 30. Fún S-alkylation, fi àyẹ̀wò náà sínú 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) kí o sì fi kún un láti inú omi ìṣúra isopropanol 200 mM fún ìṣẹ́jú 10 ní iwọ̀n otútù yàrá. A ṣe ìtọ́jú proteolytic nípa fífi 2 μg trypsin/endoproteinase Lys-C adalu (Promega UK) kún un, a sì fi sínú 37°C fún wákàtí 3. A yọ laurate surfactant nípa fífi 50 μl ethyl acetate àti 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) àti vortexing fún ìṣẹ́jú 60. A gbé ìyàsọ́tọ̀ ìpele náà lárugẹ nípa centrifugation ní 15,700 RCF fún ìṣẹ́jú márùn-ún. Gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè, a lo ọ̀wọ̀n spin C18 kan (Thermo Fisher Scientific, UK) láti fi ìfọ̀wọ́sí àti tú iyọ̀ sí ìpele ìsàlẹ̀ tí ó ní peptide náà. Lẹ́yìn gbígbẹ pẹ̀lú centrifugation vacuum, a tú àyẹ̀wò náà ká ní 0.5% TFA àti 3% acetonitrile, a sì ṣe àyẹ̀wò 500 ng nípa lílo nanoflow RP chromatography pẹ̀lú mass spectrometry nípa lílo àwọn pàrámítà ètò tí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀.
Lo MaxQuant v.1.5.3.30 (56) fún ìdámọ̀ amuaradagba àti ìwọ̀n láti wá ibi ìpamọ́ Rps. palustris proteome (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). A ti fi data mass spectrometry proteomics sínú ProteomeXchange Alliance nípasẹ̀ ibi ìpamọ́ alábàáṣiṣẹpọ̀ PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) lábẹ́ ìdámọ̀ dataset PXD020402.
Fún ìwádìí láti ọwọ́ RPLC tí a so pọ̀ mọ́ electrospray ionization mass spectrometry, a ṣe àgbékalẹ̀ RC-LH1 láti inú Rps irú wild-type. Nípa lílo ọ̀nà tí a tẹ̀ jáde tẹ́lẹ̀ (16), ìṣọ̀kan amuaradagba tí a ṣe nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì palustris jẹ́ 2 mg ml-1 nínú 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl àti 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis)) DDM. Gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè, lo ohun èlò ìwẹ̀nùmọ́ 2D (GE Healthcare, USA) láti yọ 10 μg protein jáde nípasẹ̀ ọ̀nà ìṣàn omi, kí o sì tú ìṣàn omi náà jáde nínú 20 μl 60% (v/v) formic acid (FA), 20% (v/v) Acetonitrile àti 20% (v/v) omi. A ṣe àgbéyẹ̀wò microliters márùn-ún nípasẹ̀ RPLC (Dionex RSLC) tí a so pọ̀ mọ́ mass spectrometry (Maxis UHR-TOF, Bruker). Lo MabPac 1.2×100 mm column (Thermo Fisher Scientific, UK) fún ìyàsọ́tọ̀ ní 60°C àti 100μlmin -1, pẹ̀lú gradient ti 85% (v / v) solvent A [0.1% (v / v) FA àti 0.02% (V/v) solvent omi TFA] sí 85% (v/v) solvent B [0.1%(v/v) FA àti 0.02%(v/v) nínú 90%(v/v) acetonitrile TFA] Nípa lílo orísun ionization electrospray boṣewa àti àwọn paramita aiyipada fún ju ìṣẹ́jú 60 lọ, spectrometer mass spectrometer gba 100 sí 2750 m/z (ìpíndọ́gba ibi-sí-charge). Pẹ̀lú ìrànlọ́wọ́ ojú ọ̀nà ìpèsè ExPASy bioinformatics tool FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), ṣe àfihàn spectrum mass sí àwọn subunits ti complex náà.
A gbin awọn sẹẹli naa fun wakati 72 labẹ ina NF-kekere 100 milimita (10μMm-2 s-1), alabọde (30μMm-2 s-1) tabi giga (300μMm-2 s-1). alabọde M22 (alabọde M22 ninu eyiti a yọ ammonium sulfate kuro ati sodium acetate rọpo sodium succinate) ninu igo skru-top 100 milimita (23). Ninu awọn iyipo 30-s marun, a fi awọn ilẹkẹ gilasi 0.1 micron ni ipin iwọn didun ti 1:1 lati tan awọn sẹẹli naa jẹ ki o si tutu lori yinyin fun iṣẹju 5. A yọ awọn nkan ti ko le yo, awọn sẹẹli ti ko fọ ati awọn ilẹkẹ gilasi kuro nipa lilo centrifugation ni 16,000 RCF fun iṣẹju 10 ninu microcentrifuge benchtop kan. A ya awọ ara naa kuro ninu rotor Ti 70.1 pẹlu 100,000 RCF ninu 20 mM tris-HCl (pH 8.0) pẹlu gradient sucrose 40/15% (w/w) fun wakati mẹwa.
Gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ nínú iṣẹ́ wa tẹ́lẹ̀, ìwádìí ìdènà àrùn ti àmì His lórí PufW (16). Ní ​​kúkúrú, àkópọ̀ mojuto tí a ti sọ di mímọ́ (11.8 nM) tàbí àwọ̀ ara tí ó ní ìṣọ̀kan RC kan náà (tí a pinnu nípa yíyọ ìfàsẹ́yìn kúrò nínú ìyàtọ̀ tí ó dínkù àti ìbáramu pẹ̀lú ẹrù lórí àwọ̀ ara) nínú 2x SDS loading buffer (Merck, UK) tí a ti pò lẹ́ẹ̀mejì. A ya àwọn èròjà protein náà sọ́tọ̀ lórí àwòkọ 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). A fi àwọ̀ Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) sí àwọ̀ ara jeli kan láti fi kún àti láti fojú inú wo subunit RC-L. A gbé amuaradagba tí ó wà lórí jeli kejì lọ sí membrane polyvinylidene fluoride (PVDF) methanol (Thermo Fisher Scientific, UK) fún ìwádìí ìdènà àrùn. A dí awọ ara PVDF náà nínú 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 àti 5% (w / v) tí a ti yọ́, lẹ́yìn náà a fi antibody-His primary sínú rẹ̀ (nínú Dilute the antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl àti 0.05% (v/v) Tween-20] ní 1:1000 A190-114A, Bethel Laboratories, USA) fún wákàtí mẹ́rin. Lẹ́yìn tí a ti fi omi wẹ̀ ní ìgbà mẹ́ta fún ìṣẹ́jú márùn-ún nínú aporó antibody, a fi awọ ara náà pọ̀ mọ́ aporó anti-mouse secondary anti-mouse (Sigma-Aldrich, UK) (tí a ti pò mọ́ 1:10,000 nínú aporó antibody) láti jẹ́ kí a rí i (ìṣẹ́jú márùn-ún lẹ́yìn ìwẹ̀nùmọ́ 3 nínú aporó antibody) nípa lílo substrate chemiluminescence WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italy) àti Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Nípa fífà ìpínkiri agbára ti gbogbo jeli ti a ti ya tabi immunoassay lane, sísopọ̀ agbegbe tí ó wà lábẹ́ òkè náà àti ṣíṣírò ìpínkiri agbára ti RC-L (jeli ti a ti ya) àti Protein-W (immunoassay), nínú ImageJ (57) Ṣètò àwòrán náà. Àwọn ìpínkiri wọ̀nyí ni a yípadà sí ìpínkiri molar nípa ríronú pé ìpínkiri RC-L sí protein-W nínú àyẹ̀wò RC-LH114-W mímọ́ jẹ́ 1:1 àti ṣíṣe àtúnṣe gbogbo ìṣètò dátà gẹ́gẹ́ bí ó ti yẹ.
Fún àwọn ohun èlò afikún fún àpilẹ̀kọ yìí, jọ̀wọ́ wo http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Àpilẹ̀kọ yìí jẹ́ àkójọpọ̀ tí a pín síta lábẹ́ àwọn òfin Creative Commons Attribution License. Àpilẹ̀kọ náà gba lílo láìsí ìdíwọ́, pínpín, àti àtúnṣe ní èyíkéyìí ọ̀nà tí a bá fi sí ipò pé iṣẹ́ àtilẹ̀wá náà ni a tọ́ka sí dáadáa.
Àkíyèsí: A kàn ń béèrè lọ́wọ́ rẹ láti fún ọ ní àdírẹ́sì ìmeeli rẹ kí ẹni tí o bá dámọ̀ràn sí ojú ìwé náà lè mọ̀ pé o fẹ́ kí wọ́n rí ìmeeli náà àti pé kì í ṣe àwúrúju. A kò ní gba àdírẹ́sì ìmeeli kankan.
A lo ibeere yii lati danwo boya alejo ni o ati lati dena ifisilẹ spam laifọwọyi.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Ìṣètò gíga ti ìdènà ìmọ́lẹ̀ 1 nínú ibùdó ìṣesí ń fúnni ní òye tuntun nípa ìṣiṣẹ́ quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Ìṣètò gíga ti ìdènà ìmọ́lẹ̀ 1 nínú ibùdó ìṣesí ń fúnni ní òye tuntun nípa ìṣiṣẹ́ quinone.
©2021 Ẹgbẹ Amẹrika fun Ilọsiwaju ti Imọ. gbogbo awọn ẹtọ wa ni ipamọ. AAAS jẹ alabaṣepọ ti HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ati COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.